Summary
Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione di carboidrati muro derivate.
Abstract
La necessità di fonti rinnovabili, carbon neutral, e sostenibile di materie prime per l'industria e la società è diventata una delle questioni più pressanti per il 21 ° secolo. Questo ha riacceso interesse per l'uso di prodotti vegetali come materie prime industriali per la produzione di combustibili liquidi per il trasporto
Protocol
1. Isolamento della parete cellulare
- macinare circa 60-70mg di aria o congelare materiale vegetale essiccato con 5,5 palle mm in acciaio inox in una provetta con tappo a vite 2ml Sarstedt utilizzando un retschmill (1 min, 25 Hz). In alternativa, l'uso di un high-throughput di macinazione e dosaggio iWall robot chiamato è descritto nella parte I 3.
- rimuovere le palle d'acciaio prima di continuare con la procedura di isolamento della parete cellulare
Il protocollo dettagliato della preparazione del materiale della parete cellulare è riportata nella parte I 3. Per completezza qui i passi scritti del protocollo. - aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% in acqua e vortice a fondo
- centrifugare a 10.000 rpm per 10 minuti per far sedimentare il residuo insolubile alcool
- Aspirare o decantare il surnatante
- aggiungere 1,5 ml di cloroformio / metanolo (1:1 v / v) per il residuo del tubo e agitare bene per risospendere il pellet
- centrifugare a 10.000 rpm per 10 minuti e decantare o aspirare il supernatante
- risospendere pellet in 500 ul di acetone
- evaporare il solvente con una corrente d'aria a 35 ° C fino a secco
Se necessario campioni essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente fino al procedimento successivo. - Per avviare la rimozione di amido dal campione risospendere il pellet in 1,5 ml di 0,1 M pH 5,0 sodiumacetate buffer.
- cap i tubi Sarstedt e calore per 20 min. a 80 ° C su una piastra riscaldante.
- raffreddare la sospensione su ghiaccio
- aggiungere le seguenti agenti al pellet: 35 ml di 0,01% Sodiumazide (NaN 3), 35 microlitri Amilasi (50 μg/1mL H 2 O, da specie Bacillus, SIGMA), 17 pullulanasi microlitri (18,7 unità da acidopullulyticus bacillo; SIGMA) . Chiudere la provetta e miscelare accuratamente.
- La sospensione è incubata per una notte a 37 ° C nello shaker. Orientare i tubi in orizzontale aiutanti migliorato miscelazione.
- sospensione di calore a 100 ° C per 10 minuti su una piastra riscaldante di interrompere la digestione.
- centrifuga (10.000 rpm, 10 min) e scartare il surnatante contenente amido solubilizzate
- lavare il residuo di pellet per tre volte con l'aggiunta di 1,5 ml di acqua, vortex, centriguation e decantazione delle acque di lavaggio.
- risospendere pellet in 500 ul di acetone
- evaporare il solvente con una corrente d'aria a 35 ° C fino a secco. Potrebbe essere necessario anche per rompere il materiale nel tubo con una spatola per una migliore essiccazione.
Il materiale essiccato presenta parete isolata cella (legnocellulosa). Se necessario campioni essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente fino al procedimento successivo.
2. Matrix polisaccaride composizione
Questo metodo è essenzialmente una modifica del metodo pubblicato da Albersheim 1.
- Per determinare la composizione del materiale monosaccaride muro pesare 2 mg di materiale della parete cellulare in 2ml tubi starstedt a mano o in maniera highthroughput utilizzando il iWall, un robot robot smerigliatura e di pesatura.
- Aggiungere 20 uL di una soluzione di inositolo (5mg/ml) come standard interno. Per un campione 2 parete cellulare mg si consiglia di aggiungere 100 ug.
- lavare le pareti del tubo con 250 ul di acetone per raccogliere il materiale della parete cellulare nella parte inferiore del tubo, e far evaporare l'acetone molto delicato sotto il flusso d'aria.
- Per l'idrolisi acida debole aggiungere 250 ul di 2M acido trifluoroacetico (TFA) per ogni campione. Aggiungi TFA con attenzione per garantire l'assenza di materiale è schizzato fino sulle pareti del tubo.
- cappuccio e incubare per 90 minuti a 121 ° C su una piastra riscaldante.
- raffreddare i blocchi di riscaldamento e campioni sul ghiaccio.
- centrifugare le provette a 10.000 rpm per 10 min.
- trasferire 100 ul del supernatante acido che contiene il polisaccaride derivato matrice monosaccaride ad una fiale di vetro con tappo a vite facendo attenzione a non disturbare il materiale pellet. Il pellet può essere usato per il test di cellulosa cristallina di seguito (vedi 3.)
- evaporare il TFA nel tubo di vetro sotto leggera corrente d'aria in un dispositivo di evaporazione.
- aggiungere 300 ml 2-propanolo, vortice e far evaporare a 25 ° C (da ripetere per un totale di tre volte)
- Il primo passo della procedura alditol derivatizzazione acetato è quello di eseguire una riduzione dei monosaccaridi ai loro alditols corrispondente. A tal fine aggiungere 200 ml di una soluzione di boroidruro di sodio per ogni campione essiccato. Preparare una soluzione fresca utilizzando ogni volta 10 mg di boroidruro di sodio per 1 ml di idrossido di ammonio 1M.
- lasciare flacone di vetro a temperatura ambiente per 1,5 ore
- neutralizzare la soluzione con l'aggiunta di 150 ul di acido acetico glaciale
- vortice ed evaporare a 25 ° C.
- aggiungere 250 microlitri vortice Acido acetico / metanolo (1:9, v / v), e far evaporare a 25 ˚ C
- aggiungere 250 microlitri metanolo, e far evaporare sotto il getto d'aria (ripetere per un totale di tre volte)
- Per l'acetilazione della alditols, aggiungere 50 ml di anidride acetica e 50 ml di Pyridine, vortex e incubare per 20 minuti a 121 ° C su una piastra riscaldante.
- campioni raffreddare nel blocco verso il basso con ghiaccio mentre aspettiamo diminuire temperatura a circa temperatura ambiente.
- evaporare i reagenti sotto leggera corrente d'aria a temperatura ambiente. Attenzione: acetati alditol sono altamente volatili.
- aggiungere 200 microlitri Toluene e far evaporare in aria (x3)
- Nelle fasi finali del acetati alditol vengono estratti. In primo luogo, aggiungere 500 ul di acetato di etile e agitare leggermente.
- aggiungere 2 ml di acqua, tubi e cappuccio vortice.
- centrifugare tubi a 2.000 giri per 5 minuti per ottenere chiari livelli separati (acetato di etile in alto, l'acqua sul fondo)
- pipetta 50 ul dello strato di acetato di etile in GC / MS fiale con inserti.
- diluire aggiungendo 100 ul di acetone al GC-fiala e cappuccio. Il volume del campione ed i volumi di diluizione può essere regolata per evitare di sovraccaricare il GC / MS se la concentrazione del campione è troppo alto.
La GC-flaconcino può essere conservato a 4 ° C, se il GC / MS non procedere immediatamente - I campioni vengono iniettati in un GC che è dotato di MS quadrupolo, ma un rivelatore a ionizzazione di fiamma è anche adatto. Un Supelco SP-2380 (30 mm x 0,25 x 0,25 millimetri film di micron di spessore) viene utilizzata colonna con un ritardo di 4 min solvente e una portata di 1.5ml/min. Iniettati campioni sono sottoposti al seguente programma di temperatura: tenere iniziale a 160 ° C per 2 min a 20 ° C / rampa min a 200 ° C e mantenere per 5 min a 20 ° C / rampa min a 245 ° C e mantenere 12 min, picco a 270 ° C e mantenere per 5 minuti prima di raffreddamento alla temperatura iniziale di 160 ° C 2.26) Cime sono identificati da profili di massa e / o tempi di ritenzione degli standard.. Monosaccaridi vengono quantificati sulla base di curve standard.
3. Cellulosa Contenuto cristallino
Questo metodo è essenzialmente descritto da Updegraf 8. Ci sono un certo numero di materie prime per questa procedura: Isolato materiale della parete cellulare (vedi punto 1) o materiale muro che è già stato trattato con 2M TFA (vedi 2.8) o il restante pellet immediatamente dopo il trattamento con acido (vedi 2.8) o un TFA pellet, che è stato lavato con 2-propanolo e asciugato.
- Aggiungere al pellet TFA nel tubo di vetro con tappo a vite 1 ml di reagente Updegraff (Acido acetico: acido nitrico: acqua, 08:01:02 v / v).
- Tubo tappo, vortice, e il calore su una piastra riscaldante a 100 ° C per 30 min. Come risultato di questo trattamento solo cellulosa cristallino rimane insolubile in pellet.
- Campioni raffreddare nel blocco di ghiaccio a temperatura ambiente o fredda
- campioni centrifugare a 10.000 rpm per 15 minuti
- Gettare il surnatante garantire che il pellet non è disturbato e non materiale il pellet viene rimosso. A questo scopo lasciare ca. 150 ul di surnatante nel tubo.
- aggiungere 1,5 ml di acqua, scuotere, centrifuga, il surnatante come fatto sopra
- ripetere il lavaggio procedura 3 volte aggiuntivi utilizzando 1,5 ml di acetone
- Aria secca pellet molto delicatamente con l'aria, o lasciare asciugare sulla panchina durante la notte
- il pellet (cellulosa cristallina) è ora completamente idrolizzato in glucosio da quello che viene chiamato un idrolisi Saeman. A tal fine aggiungere 175 microlitri di acido solforico 72% al tubo Sarstedt
- incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, vortex e incubare per altri 15 min
- aggiungere 825 microlitri di acqua e vortice
- centrifugare i campioni a 10.000 rpm per 5 min. Ci potrebbe essere qualche materiale marrone insolubile, lignina, rimanendo nel tubo.
- Il contenuto di glucosio del supernatante viene analizzato utilizzando il test colorimetrico anthrone. Questo test viene eseguito in una piastra da 96 pozzetti microtiter di polistirene.
- Per la curva standard di utilizzare un magazzino 1mg/ml glucosio (conservato a 0 ° C) e creare duplicati 0, 2, 4, 6, 8 e 10 ug standard pipettando 0, 2, 4, 6, 8, e 10 ul in separato ben appropriato. Riempire ogni pozzetto fino a 100 ul con l'acqua.
- aggiungere 10 ml di ciascun supernatante campione e 90 ml di acqua in celle separate, ma sulla stessa micropiastra come standard.
- aggiungere 200 ml di reagente Anthrone preparati al momento (Anthrone sciolto in acido solforico concentrato, anthrone 2 mg / ml di acido solforico)
- di calore a piastre per 30 minuti a 80 ° C in un forno (calore diffusore in alluminio). Campioni contenenti glucosio passa da giallo a verde-blu.
- lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente e agitare bene.
- leggere l'assorbimento della piastra a 625 mm, utilizzando un lettore di micropiastre.
- Glucosio (e quindi contenuto di cellulosa cristallina) viene calcolato in base l'assorbanza rispetto alla curva standard stabilito sulla stessa piastra.
4. Rappresentante Risultati
Un esempio di analisi muro è presentato in figura 2. In questo caso fusto di pioppo (legno) è stato analizzato mediante le varie procedure descritte nella sezione protocollo. La matrice del Pocomposizione lysaccharide è evidenziato da un cromatogramma esempio identificare i presenti tipico zucchero nelle pareti cellulari delle piante, fucosio, ramnosio, xilosio, arabinosio, galattosio, mannosio e glucosio (e l'inositolo standard interno). Il componente principale hemicellulosic di pioppo è xilano come dimostrato dal contenuto xilosio alto. Tuttavia, l'abbondanza di questi zuccheri varia a seconda della materia prima used4. Il glucosio in questa analisi è derivata dalla xyloglucan emicellulosa e cellulosa amorfa. Grazie all'analisi dei dati può essere presentato come mol% o ug / mg di materiale della parete (o il peso secco). Il contenuto di cellulosa cristallina è auto-esplicativo, ci si può aspettare tra i valori del 20-50% del peso a secco della parete. Sulla base dei risultati qui presentati e I3 in parte la composizione lignocellulosica di legno di pioppo è del 21% lignina, emicellulose 30%, e il 41% di cellulosa cristallina. Il resto sarebbe cenere.
Figura 1:. Panoramica di analisi lignocellulosici pareti cellulari (legnocellulosa) sono isolati dal greggio materiale vegetale essiccato. Il materiale della parete viene poi pesata in aliquote e suddiviso per i vari metodi. Composizione polisaccaride matrice è stabilito dopo il trattamento il materiale muro con un acido debole (2M TFA), la derivatizzazione monosaccaridi risultante solubilizzato alla loro acetati alditol e analisi mediante GC-MS. Il residuo del trattamento con acido debole è lavato con la cosiddetta reagente Updegraff lasciando solo cellulosa insolubile crystlline dietro. La cellulosa è solubilizzato in acido solforico e quantificato mediante un saggio colorimetrico determinazione del contenuto di glucosio. In parallelo, il contenuto e la composizione della lignina può essere determinata come descritto nella parte I 3.
Figura 2:. Completa analisi lignocellulosici di legno di pioppo Cippato di pioppo (Populus tremoloides) sono stati sottoposti al protocollo descritto.
In alto a sinistra: composizione Matrix polisaccaride; Fuc fucosio; Rha ramnosio, arabinosio Ara; Xyl xilosio, l'uomo il mannosio; Gal galattosio, glucosio Glc, inositolo standard interno.
Discussion
I metodi descritti permettono una rapida valutazione quantitativa della composizione della biomassa vegetale lignocellulosiche. Il metodo consente la determinazione della composizione di tali materiali tra cui la composizione di zucchero dei polisaccaridi matrice cioè la emicellulose, il contenuto di cellulosa cristallina. La velocità dei vari metodi analitici per persona varia. Utilizzando i protocolli descritti qui, 20 campioni possono essere trattati per le composizioni polisaccaride matrice e 30 per i contenuti di cellulosa cristallina. A causa della natura quantitativa della materia prima ottimale dei dati raccolti, varietà o genotipi può essere valutata in termini di idoneità per la produzione di biocarburanti.
Acknowledgments
Siamo grati a Matthew Robert Weatherhead eccellente per il servizio tecnico e John Ralph, University of Wisconsin per preziosi consigli, discussioni, e il campione di legno di pioppo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Scienze Chimiche, Scienze geologiche e Bioscienze Divisione, Ufficio di Basic Sciences Energy, Office of Science, US Department of Energy (nessun premio. DE-FG02-91ER20021) e dal US Department of Energy (DOE) Grandi Laghi Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| Sodium Borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Pyridine | JT Baker | 3348-01 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 7890A GC/5975C MSD | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Retsch Mill | Qiagen | TissueLyser II | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Albersheim, P. A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
- UPDEGRAF, D. M. SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS. Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).
