Summary
Растительной биомассы является одним из основных углеродно-нейтральным возобновляемым ресурсом, который может быть использован для производства биотоплива. Растительной биомассы в основном состоит из клеточных стенок, структурно-сложных композитных материалов называют lignocellulosics. Здесь мы опишем протокол для всестороннего анализа содержания и состава стене производным углеводов.
Abstract
Необходимость возобновляемых, нейтральным уровнем эмиссии углерода и устойчивого сырья для промышленности и общества стала одной из самых актуальных вопросов для 21-го века. Это возродило интерес к использованию растительных продуктах, как промышленное сырье для производства жидкого топлива для транспорта
Protocol
1. Изоляции клеточной стенки
- молоть примерно 60-70мг воздушно-или сублимированных растительного материала с 5,5 мм из нержавеющей стали в шары винт 2 мл Sarstedt колпачок трубки использованием retschmill (1 мин, 25 Гц). Альтернативы, использование высокой пропускной способностью шлифования и дозирования робота называют iWall описан в Части I 3.
- удалить стальных шаров, прежде чем продолжить изоляцию процедуры клеточной стенки
Подробный протокол подготовки клеточного материала стен показано в Части I 3. Для полноты картины здесь письменного шагов протокола. - добавить 1,5 мл 70% водного этанола, и вихревые тщательно
- центрифуге при 10 000 оборотов в минуту в течение 10 мин для осаждения спиртом нерастворимый остаток
- аспирата или переливать супернатант
- добавить 1,5 мл хлороформ / метанол (1:1 об / об) решение остатков и тщательно встряхнуть трубку для ресуспендирования гранул
- центрифуге при 10 000 оборотов в минуту в течение 10 мин и аспирата или переливать супернатант
- ресуспендируют осадок в 500 мкл ацетона
- испарится растворитель с потоком воздуха при 35 ° С до полного высыхания
При необходимости высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре до дальнейшей обработки. - Для начала удаления крахмала из образцов повторно приостанавливать гранулы в 1,5 мл 0,1 М sodiumacetate буфера рН 5,0.
- колпачок Sarstedt труб и огне в течение 20 мин. при 80 ° С в нагревательном блоке.
- прохладный подвески на льду
- добавьте следующие агенты гранул: 35 мкл 0,01% Sodiumazide (NaN 3), 35 мкл амилазы (50 μg/1mL H 2 O; из видов Bacillus, SIGMA), 17 мкл Pullulanase (18,7 единиц из палочки acidopullulyticus; SIGMA) . Крышка трубки и вихревые тщательно.
- Подвеска инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С в шейкере. Ориентируемся трубы горизонтально помощники улучшение перемешивания.
- тепла подвески при 100 ° С в течение 10 мин в нагревательный блок прекратить пищеварение.
- центрифуга (10.000 оборотов в минуту, 10 мин) и отбросить супернатант, содержащий солюбилизированного крахмала
- мыть оставшиеся гранулы в три раза, добавляя 1,5 мл воды, вортексе, centriguation и перефасовки промывных вод.
- ресуспендируют осадок в 500 мкл ацетона
- испарится растворитель с потоком воздуха при 35 ° С до полного высыхания. Это может быть необходимо также, чтобы разбить материал в пробирке с помощью шпателя для лучшей сушки.
Высушенный материал представляет изолированных клеточных стенок (lignocellulosics). При необходимости высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре до дальнейшей обработки.
2. Матрица полисахаридный состав
Этот метод является по существу модификацией метода опубликована Albersheim 1.
- Для определения моносахаридов состава материала стены весят 2 мг клеточной стенки материала в 2 мл труб starstedt либо вручную, либо в highthroughput способом с помощью iWall, робот шлифовки и весом робота.
- Добавьте 20 мкл Инозитол решение (5mg/ml) в качестве внутреннего стандарта. Для 2 мг образца клеточной стенки, мы рекомендуем добавить 100 мкг.
- промыть стенки трубы с 250 мкл ацетона собирать материал клеточной стенки в нижней части трубки, и испаряются ацетона очень нежный под потоком воздуха.
- Для слабого кислотного гидролиза добавьте 250 мкл 2М трифторуксусной кислоты (ТФК) для каждого образца. Добавить TFA тщательно, чтобы убедиться в отсутствии материала брызги вверх на стенках труб.
- крышка плотно и инкубировать в течение 90 мин при температуре 121 ° С в нагревательном блоке.
- прохладный отопления блоков и образцов на льду.
- Центрифуга труб при 10000 оборотов в минуту в течение 10 мин.
- Передача 100 мкл кислой супернатант, содержащий матрицу полисахарид, полученный моносахаридов на стакан колпачок флакона убедившись, чтобы не нарушить материала гранул. Гранулы могут быть использованы для анализа кристаллических целлюлозы ниже (см. 3.)
- испаряются ТФК в стеклянной трубке под струю воздуха в испарении устройства.
- добавить 300 мкл 2-пропанол, вихревые и испаряются при температуре 25 ° C (повтор в общей сложности три раза)
- Первый этап процедуры alditol производных ацетата для выполнения снижения моносахариды в соответствующие alditols. Для этого добавьте 200 мкл раствора натрия боргидрида каждому высушенного образца. Подготовка свежий раствор каждый раз используя 10 мг натрия боргидрида в 1 мл 1М гидроксида аммония.
- оставить стекло флакона при комнатной температуре в течение 1,5 часов
- нейтрализовать решение путем добавления 150 мкл ледяной уксусной кислоты
- вихря и испаряется при температуре 25 ° C.
- добавить 250 мкл уксусной кислоты вихревой / метанол (1:9, об / об), и испаряются при температуре 25 ˚ C
- добавить 250 мкл метанола, и испаряются под потоком воздуха (повтор в общей сложности три раза)
- Для ацетилирования alditols, добавить 50 мкл уксусного ангидрида и 50 мкл пиридНИС, вихревые и инкубировать в течение 20 мин при температуре 121 ° С в нагревательном блоке.
- прохладном образцов в блок вниз со льдом в то время как ждать температура снизится до примерно комнатной температуры.
- испаряются реагентов под струю воздуха при комнатной температуре. Будьте осторожны: alditol ацетаты крайне неустойчивой.
- добавить 200 мкл толуол и испаряются под воздухом (x3)
- В последние шаги alditol ацетаты извлекаются. Во-первых, добавить 500 мкл этилацетата и вихревые слегка.
- добавить 2 мл воды, крышка труб и вихря.
- центрифужные пробирки при 2000 оборотов в течение 5 мин до получения четких отдельных слоев (этилацетат сверху, вода снизу)
- пипетки 50 мкл слой этилацетата в ГХ / МС флаконы со вставками.
- разбавленных добавлением 100 мкл ацетона GC-флакона и крышки. Объем образца и разбавление объемы могут быть скорректированы, чтобы избежать перегрузки GC / MS, если в образце концентрация слишком высока.
GC-флакон можно хранить при температуре 4 ° С, если ГХ / МС анализ не сразу приступить - Образцы вводятся в GC, который оснащен квадрупольного MS, но детектором ионизации пламени также подходит. Supelco SP-2380 (30 мм х 0,25 мм х 0,25 мкм, толщина пленки) столбец используется с 4мин растворителя задержки и скорость потока 1.5ml/min. Введенный образцы подвергаются следующую программу температура: Начальная держать при температуре 160 ° С в течение 2 мин, 20 ° С / мин рампы до 200 ° С и удерживать в течение 5 мин; 20 ° С / мин рампы до 245 ° C и удерживайте 12 мин; шип до 270 ° C и удерживайте в течение 5 минут перед охлаждением до начальной температуры 160 ° C 2,26) Пикс идентифицируются по массе профилей и / или время удерживания стандартов.. Моносахариды количественно на основе стандартных кривых.
3. Кристаллическая содержание целлюлозы
Этот метод, по существу описывается Updegraf 8. Есть целый ряд исходных материалов для этой процедуры: изолированные материал клеточной стенки (см. 1) или стенового материала, который уже обработанные 2М ТФК (см. п. 2.8) либо оставшиеся гранулы сразу же после кислотной обработки (см. п. 2.8) или ТФК гранулы, которые были промывают 2-пропанолом и высушивают.
- Добавить в TFA пеллет в винтовой ограничен стеклянной трубки 1 мл реагента Updegraff (уксусная кислота: азотная кислота: вода, 8:01:02 / об).
- Крышка трубки плотно, вихревые, и тепло в отопительный блок при температуре 100 ° С в течение 30 мин. В результате такого лечения только кристаллическая целлюлоза остается нерастворимый в гранулах.
- Прохладный образцов в блоке на льду до комнатной температуры или холоднее
- Центрифуга образцов при 10000 оборотов в минуту в течение 15 мин
- Удалите надосадочную обеспечение того, чтобы шарик не нарушается и никаких материалов из гранул удаляется. Для этой цели оставить ок. 150 мкл надосадочной в трубке.
- добавить 1,5 мл воды, встряхивают, центрифугу, и отбросить супернатант, как это сделано выше
- повторите процедуру промывки 3 дополнительных раз, используя 1,5 мл ацетона
- Воздух сухой шарик очень осторожно с воздухом, или дайте высохнуть на скамейке ночь
- гранул (кристаллическая целлюлоза) в настоящее время полностью гидролизованный в глюкозу, что называется гидролизом Saeman. Для этого добавить 175 мкл 72% серной кислоты, чтобы трубка Sarstedt
- инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин, вихревые и инкубировать в течение еще 15 мин
- добавить 825 мкл воды и вихревые
- Центрифуга образцов при 10000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Там могут быть некоторые коричневые нерастворимого вещества, лигнин, оставшиеся в трубе.
- Содержание глюкозы супернатант анализировали использованием колориметрического анализа антрон. Этот анализ выполняется в 96-планшет полистирола.
- Для стандартной кривой использовать 1mg/ml фондовом глюкозы (хранить при температуре 0 ° С) и создать дубликат 0, 2, 4, 6, 8 и 10 мкг стандартов с помощью пипетки 0, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл на отдельные соответствующие хорошо. Заполните каждую лунку до 100 мкл с водой.
- добавить 10 мкл каждого образца супернатанта и 90 мл воды на отдельные клетки, но в тот же планшет в качестве стандарта.
- добавить 200 мкл свежеприготовленного антрон реагент (антрон растворяется в концентрированной серной кислоты, 2 мг антрон / мл серной кислоты)
- пластинчатый теплообменник в течение 30 мин при 80 ° С в печи (разбрасыватель алюминия тепла). Глюкоза с образцами свою очередь, от желтого на сине-зеленый.
- Пусть пластинка остыть до комнатной температуры и встряхнуть основательно.
- читать поглощения пластины на 625 мм с помощью устройства чтения планшет.
- Глюкоза (и, следовательно, кристаллическое содержание целлюлозы) рассчитывается на основе поглощения по сравнению со стандартной кривой создан на той же пластинке.
4. Представитель Результаты
Пример анализа стены представлена на рисунке 2. В этом случае стволовые тополь (дерево) были проанализированы различные процедуры, изложенные в протоколе разделе. Матрицы Роlysaccharide композиция подсвечивается пример хроматограммы определения типичных настоящее время сахар в стенах растительной клетки, фукозы, рамнозу, ксилозы, арабинозы, галактозы, маннозы и глюкозы (и внутреннего стандарта инозитол). Основным компонентом hemicellulosic тополь ксилан о чем свидетельствует высокое содержание ксилозы. Тем не менее, обилие эти сахара будет варьироваться в зависимости от исходного сырья used4. Глюкозы в этом анализе является производным от xyloglucan гемицеллюлозы и аморфная целлюлоза. Из анализа данные могут быть представлены как моль% или мкг / мг материал стен (или сухой вес). Содержание кристаллической целлюлозы говорит само за себя, можно ожидать, значения между 20-50% от сухого веса стены. На основании результатов, представленных здесь, и в части I3 лигноцеллюлозных состав древесины тополя на 21% лигнина, 30% гемицеллюлозы, а 41% кристаллической целлюлозы. Остальные будут пепла.
Рисунок 1:. Обзор лигноцеллюлозных анализ Клеточные стенки (lignocellulosics) выделяют из сырого высушенного материала растений. Материал стен, то взвешенный на аликвоты и подразделяется на различные анализы. Матрица полисахарид состава устанавливается после обработки материал стены со слабой кислоты (ТФК 2М), дериватизирующего результате солюбилизированного моносахаридов их alditol ацетаты, и анализ методом ГХ-МС. Остатки слабые лечения кислоты промывают так называемые Updegraff реагента оставив только нерастворимый целлюлозы crystlline позади. Целлюлоза растворяется серной кислоты и количественно с помощью колориметрического анализа определения содержания глюкозы. Параллельно с этим, состав и содержание лигнина может быть определена как описано в части I 3.
Рисунок 2:. Всеобъемлющее лигноцеллюлозных анализ древесины тополя Щепа от тополь (Populus tremoloides) были подвергнуты описаны протоколом.
Вверху слева: Matrix состав полисахарида; Fuc фукозы; Rha рамноза; Ара арабинозы, ксилозы XYL; Человек маннозы; Гал галактозы; Glc глюкозы; инозитол внутреннего стандарта.
Discussion
Описанные методы позволяют быстро количественной оценки состава лигноцеллюлозных биомассы растений. Метод позволяет определить состав таких материалов, включая сахар состава матрицы полисахаридов, а именно гемицеллюлоз, кристаллический содержанием целлюлозы. Пропускная способность различных аналитических методов на человека меняется. Использование протоколов, описанных здесь, 20 образцов могут быть обработаны для матричных композициях полисахаридов и 30 для кристаллических содержанием целлюлозы. Из-за количественного характера данных оптимальных культур сырья, разновидности или генотипов может быть оценен с точки зрения их пригодности для производства биотоплива.
Acknowledgments
Мы благодарны Мэттью Роберт Уэзерхед за прекрасную техническую и Джон Ральф, Университет Висконсина за ценные советы, обсуждения и образцы древесины тополя. Эта работа финансировалась химических наук, наук о Земле и биологических наук отдела Управления основной энергии наук, Управление по науке, Министерство энергетики США (награда нет. DE-FG02-91ER20021) и Министерства энергетики США (DOE) Великих озер Биоэнергетика Научно-исследовательский центр (DOE BER Управление по науке DE-FC02-07ER64494).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| Sodium Borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Pyridine | JT Baker | 3348-01 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 7890A GC/5975C MSD | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Retsch Mill | Qiagen | TissueLyser II | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Albersheim, P. A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
- UPDEGRAF, D. M. SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS. Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).
