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Biology

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

La vidéo d'accompagnement décrit l'utilisation du système de fractionnement GELFREE 8100, les partitions des échantillons protéiques complexes sur la base du poids moléculaire et récupère les fractions en phase liquide. La vidéo décrit comment la technologie fonctionne, comment il est utilisé, et fournit des données résultantes, avec analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide d'homogénat de foie fractionnée bovine.

Abstract

Le système de fractionnement GELFREE 8100 est un système de nouvelle protéine fractionnement conçu pour maximiser la récupération des protéines au cours du fractionnement poids moléculaire basée. Le système est composé d'une seule utilisation, les cartouches capacité de 8-échantillon et un instrument de paillasse Fractionnement GELFREE. Durant la séparation, une tension constante est appliquée entre l'anode et la cathode réservoirs, et sur chaque mélange protéine est électrophorétiquement entraînés par une chambre de chargement dans une colonne de gel gel spécialement conçu. Les protéines sont concentrées dans une bande étroite dans un gel de concentration, et séparés en fonction de leurs mobilités électrophorétiques respectives dans un gel de résolution. Comme les protéines éluées de la colonne, ils sont piégés et concentré en phase liquide dans la chambre de collecte, libre du gel. L'instrument est alors interrompue à intervalles de temps spécifiques, et les fractions sont recueillies à l'aide d'une pipette. Ce processus est répété jusqu'à ce que toutes les fractions désirées ont été recueillies. Si moins de 8 échantillons sont analysés sur une cartouche, toute chambres inutilisées peuvent être utilisées dans les séparations ultérieures.

Cette nouvelle technologie facilite la séparation simple et rapide de jusqu'à 8 mélanges complexes de protéines simultanément, et offre plusieurs avantages comparativement aux méthodes de fractionnement disponibles auparavant. Ce système est capable de fractionnement jusqu'à 1 mg de protéines totales par canal, pour un total de 8 mg par cartouche. Protéines intactes sur une gamme large masse sont séparés sur la base du poids moléculaire, en conservant importantes propriétés physico-chimiques de l'analyte. Le piégeage en phase liquide prévoit le recouvrement élevé tout en éliminant le besoin de bande ou de coupe endroit, rendant le procédé de fractionnement très reproductible 1.

Protocol

1. Préparation de protéines de l'échantillon

  1. Dans un tube de 500 ul microcentrifugeuse, combiner les éléments suivants:
Réactifs Volume d'ajouter:
* Échantillon de protéines (jusqu'à 1 mg) Jusqu'à 112 uL
Tampon d'échantillon (5X) fourni en cartouche kit 30 uL
TNT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x uL d'un total de volume d'échantillon de 150μL **
  1. Dénaturer les échantillons à 95 ° C pendant 5 minutes. Laisser refroidir à température ambiante.

* Le montant total de la protéine d'être séparé dépendra de la complexité de l'échantillon. Pour des échantillons plus complexes, tels que homogénat tissulaire, 150-200 mg par canal est recommandée.

** Si le volume de l'échantillon est inférieure à 112 uL, ajouter 18 Ω H 2 O pour amener le volume final à 150 pi.

2. Chargement de la cartouche GELFREE

  1. Retirez la cartouche GELFREE 8100 du sachet en aluminium.
  2. Retirez et jetez le scellant la plaque.
  3. Retirez le tampon de stockage de l'compartiments de la cartouche à l'aide d'une pipette. Si les 8 chambres de la cartouche sera utilisée, la cartouche peut être inversée pour drainer le tampon de stockage des compartiments.
  4. Préparation de la cartouche pour le chargement en ajoutant GELFREE Tampon Courir pour chacune des chambres cartouche comme suit:
GELFREE Cartouche Chambre Volume de tampon GELFREE Exécution d'ajouter
Réservoir tampon d'anode 8 ml
Réservoir tampon cathode 6 ml
Collection chambres 100 uL de chaque
  1. Retirez et jetez les tampons de la chambre de chargement des échantillons.
  2. Chargez les 150 échantillons uL dans les chambres de chargement à l'aide une pipette à 8 canaux.
  3. Placez la cartouche chargée dans la Station GELFREE Fractionnement 8100. Bas matrices d'électrodes et fermer le couvercle.

3. Exécution de la cartouche

  1. En utilisant l'affichage de l'instrument s à écran tactile, appuyez sur le bouton méthode pour afficher la liste des méthodes préprogrammées. Chacune des méthodes pré-programmées se compose de tensions et de mettre en fonction du temps des pauses visant à résoudre les protéines au sein d'une gamme spécifique de poids moléculaires. Le 8100 GELFREE automatiquement une pause pour la collecte de fractions à des intervalles spécifiés dans la méthode.
  2. Une fois la méthode appropriée a été identifié, appuyez sur le bouton de récupérer, et entrez le numéro de l'désiré pré-programmés méthode utilisant le clavier à l'écran. Appuyez sur OK, puis appuyez sur le bouton Appliquer. La méthode qui a été appliquée apparaîtra au bas de l'écran principal.
  3. Pour sélectionner les canaux (nombre d'échantillons) qui seront utilisées dans la course, appuyez sur le bouton de canal sur l'écran principal. Pour sélectionner l'ensemble des huit canaux, appuyez sur sélectionner tous. Ensuite, appuyez sur Terminé pour revenir à l'écran principal.
  4. Assurez-vous que le couvercle de protection est fermée et que le voyant est vert au bas de l'écran.
  5. Pour commencer la séparation des protéines, appuyez sur Start. La station de fractionnement sera automatiquement en pause quand il est temps de rassembler les fractions. Note: Bien que le système est en marche, les cercles indiqué dans la boîte sur le côté gauche de l'écran représentent l'état de chaque canal. Un cercle vert indique que le canal est actif, un cercle jaune indique que l'instrument a fait une pause, et un cercle rouge indique que le canal a échoué. Les courants et tensions appliqués sont affichés à droite des cercles état ​​du canal. Les fractions ne doit être retiré lorsque le statut de cercles ont viré au jaune et une alerte de texte apparaît sur ​​l'écran de l'instrument de s.
  6. Pour enlever les fractions, ouvrez le couvercle de l'instrument et l'utilisation d'une pipette à 8 canaux pour retirer 150 pi de chacun des bassins de collecte.
  7. Une fois les fractions ont été enlevés, se laver la chambre de collecte deux fois avec du tampon du film GELFREE en ajoutant 100 ul par canal et le pipetage haut et en bas deux fois.
  8. Après le lavage, ajouter 100 ul d'GELFREE Tampon retour dans les chambres de collecte, de fermer le couvercle et appuyez sur le bouton de reprise.
  9. Le GELFREE 8100 se déroulera jusqu'au prochain intervalle de temps. Le temps total restant dans l'expérience est montré sur le côté droit de l'écran. Pour basculer entre le temps restant, le temps écoulé et le temps de pause, appuyez sur le bouton ci-dessus la boîte affichant le temps.
  10. Une fois toutes les fractions ont été collected, ils peuvent être immédiatement utilisés pour la préparation en aval, tels que la focalisation isoélectrique ou électrophorèse sur gel, ou pour l'analyse des liquides en utilisant la spectrométrie de masse chromatographie ou d'immunoaffinité.

4. Les résultats représentatifs

Un mg d'homogénat de foie 200 bovins a été divisée en 12 fractions chacun, en utilisant le système de fractionnement GELFREE. 6 uL de chaque fraction a été exécuté sur un gel PAGE 1D SDD et colorés à l'argent. Comme le montre la figure 1, l'échantillon de protéine a été fractionné en 12 fractions distinctes, couvrant toute la gamme de poids moléculaire de 150kDa 3.5kDa d'. Un standard de poids moléculaire (ColorBurst, Sigma) sont également indiquées dans les lignes 1 et 14. Le gel présentés ici met en évidence le taux élevé de recouvrement réalisé en utilisant les GELFREE 8100 du système de fractionnement des protéines. Le gel montré ici représente 4% de la protéine récupéré à partir de 200 ug.

Figure 1
Figure 1. Les protéines de foie de boeuf homogénat séparés en utilisant le système de fractionnement GELFREE. 6 uL de chaque fraction 150 pi a été chargé et exécuté sur un gel SDS-PAGE 1D et colorés à l'argent. Un poids moléculaire (MW) la norme a également été chargé comme indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.

Discussion

Le système de fractionnement GELFREE 8100 fournit une méthode rapide et simple et reproductible pour le partitionnement des échantillons de protéines complexes en fonction du poids moléculaire discrète fractions. Cette nouvelle méthode de fractionnement élimine le besoin de bande ou de coupe au comptant, ce qui permet d'isoler les protéines sur une gamme large masse en 90 minutes. La possibilité de charger des quantités relativement importantes de l'échantillon et de récupérer les fractions en phase liquide est particulièrement utile dans l'isolement et l'analyse des protéines de faible abondance, qui sont généralement plus difficiles à détecter. Les fractions obtenues peuvent ensuite être utilisés dans un large éventail d'applications, telles que la LC-MS, MALDI-TOF, et immunoblot.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide
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Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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