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Biology

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

O vídeo que acompanha descreve o uso do Sistema de Fracionamento GELFREE 8100, que partições amostras de proteínas complexas com base no peso molecular e recupera as frações em fase líquida. O vídeo descreve como a tecnologia funciona, como ele é usado, e fornece dados resultantes, com análise de eletroforese em gel de poliacrilamida de homogenato de fígado bovino fracionado.

Abstract

O Sistema de Fracionamento GELFREE 8100 é um sistema de fracionamento de proteínas romance projetado para maximizar a recuperação de proteínas durante o fracionamento do peso molecular baseado. O sistema é composto de uso único, os cartuchos de oito amostras de capacidade e uma bancada Instrumento Fracionamento GELFREE. Durante a separação, uma tensão constante é aplicada entre o anodo eo catodo reservatórios, e cada mistura de proteínas é eletroforeticamente expulsos de uma câmara de carga em um gel especialmente concebido gel coluna. Proteínas estão concentrados em uma faixa apertada em um gel de empilhamento, e separados com base em suas respectivas mobilidades eletroforéticas em gel de resolução. Como proteínas saem da coluna, eles estão presos e concentrado em fase líquida na câmara de coleta, livre do gel. O instrumento é então fez uma pausa em intervalos de tempo específicos, e as frações são coletados por meio de uma pipeta. Este processo é repetido até que todas as frações desejadas tenham sido coletados. Se menos de 8 amostras são executados em um cartucho, qualquer câmaras não utilizado pode ser utilizado em separações subseqüentes.

Esta nova tecnologia facilita a separação rápida e simples de até 8 misturas complexas de proteínas simultaneamente, e oferece diversas vantagens quando comparado aos métodos de fracionamento disponíveis anteriormente. Este sistema é capaz de fracionamento de até 1 mg de proteína total por canal, para um total de 8mg por cartucho. Proteínas intactas em uma faixa de grande massa são separadas com base no peso molecular, mantendo importantes propriedades físico-químicas do analito. O aprisionamento de fase líquida prevê recuperação alta, enquanto eliminando a necessidade de banda ou corte no local, tornando o processo de fraccionamento altamente reprodutível 1.

Protocol

1. Preparação de proteínas da amostra

  1. Em um tubo de microcentrífuga 500 mL, combine o seguinte:
Reagente Volume de acrescentar:
* Amostra de proteína (até 1 mg) Até 112 mL
Tampão de amostra (5X) fornecido em cartucho kit 30 mL
TDT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x mL para um total de volume de amostra de 150μL **
  1. Desnaturar as amostras a 95 ° C por 5 minutos. Arrefecer à temperatura ambiente.

* A quantidade total de proteína a ser separados dependerá da complexidade da amostra. Para amostras mais complexas, tais como tecido homogeneizado, 150-200 mg por canal é recomendado.

** Se o volume da amostra é inferior a 112 mL, adicionar 18 Ω H 2 O para trazer o volume final de 150 mL.

2. Carregar o cartucho GELFREE

  1. Remova o cartucho de 8100 GELFREE da embalagem de alumínio.
  2. Remova e descarte o selador de placa.
  3. Remover o buffer de armazenamento dos compartimentos do cartucho com uma pipeta. Se todos os 8 câmaras do cartucho será utilizado, o cartucho pode ser invertida para drenar o buffer de armazenamento dos compartimentos.
  4. Prepare o cartucho para carregar adicionando tampão de corrida GELFREE para cada uma das câmaras do cartucho da seguinte forma:
GELFREE Cartucho Câmara Volume de GELFREE tampão de corrida para adicionar
Reservatório de tampão ânodo 8 mL
Catodo reservatório tampão 6 mL
Coleta de câmaras 100 L cada
  1. Remover e descartar qualquer tampão da câmara de carga da amostra.
  2. Carregar os 150 amostras mL para as câmaras de carregamento com uma pipeta de 8 canais.
  3. Coloque o cartucho carregado na Estação Fracionamento GELFREE 8100. Inferiores as matrizes de eletrodos e feche a tampa.

3. Executando o cartucho

  1. Utilizar o instrumento s tela sensível ao toque, pressione o botão método para ver a lista de pré-programadas métodos. Cada um dos métodos pré-programados consiste em definir e tensões baseadas em tempo pausas destinadas a resolver as proteínas dentro de uma faixa específica de pesos moleculares. O 8100 GELFREE automaticamente pausa para coleta de fração nos intervalos especificados no método.
  2. Uma vez que o método adequado foi identificado, pressione o botão recuperar, e digite o número desejado do método de pré-programados usando o teclado na tela. Pressione ok, em seguida, pressione o botão aplicar. O método que tem sido aplicado irá aparecer na parte inferior da tela principal.
  3. Para selecionar os canais (número de amostras) que será usado na corrida, pressione o botão de canal na tela principal. Para selecionar todos os oito canais, pressione selecionar todos. Em seguida, pressione feito para voltar à tela principal.
  4. Garantir que a tampa de segurança é fechada e que o indicador está verde na parte inferior da tela.
  5. Para começar a separação de proteínas, pressione o começo. A Estação de Fracionamento automaticamente pausa quando é hora de coletar frações. Nota: Enquanto o sistema estiver em execução, os círculos mostrados na caixa do lado esquerdo da tela retratam o estado de cada canal. Um círculo verde indica que o canal está ativo, um círculo amarelo indica que o instrumento tem uma pausa e um círculo vermelho indica que o canal tenha falhado. As tensões e correntes aplicadas são exibidos à direita dos círculos status do canal. Frações só deve ser removido quando o status de círculos ficaram amarelas e um alerta de texto aparece na tela do instrumento s.
  6. Para remover frações, abra a tampa do instrumento e usar uma pipeta de 8 canais para retirar 150 mL de cada uma das câmaras de coleta.
  7. Uma vez que as frações foram retiradas, lave a câmara de coleta duas vezes com tampão de corrida GELFREE adicionando 100 ul por canal e pipetando para cima e para baixo duas vezes.
  8. Após a lavagem, adicione 100uL de GELFREE tampão de corrida de volta para as câmaras de coleta, feche a tampa e pressione o botão Continuar.
  9. O GELFREE 8100 vai decorrer até ao próximo intervalo. O tempo total restante no experimento é mostrado no lado direito da tela. Para alternar entre o tempo restante, tempo decorrido e tempo de pausa, pressione o botão acima da caixa de exibição de tempo.
  10. Depois de todas as frações foram collected, eles podem ser imediatamente utilizada para a preparação mais a jusante, como a focalização isoelétrica ou eletroforese em gel, ou para análise por espectrometria de massa de cromatografia líquida ou de imunoafinidade.

4. Resultados representante

A mcg 200 de homogeneizado de fígado bovino foi dividido em 12 frações de cada um, utilizando o Sistema de Fracionamento GELFREE. 6 mL de cada fração foi executado em um padrão de gel PAGE 1D SDS e corados de prata. Conforme mostrado na Figura 1, a amostra de proteína foi fracionado em 12 frações distintas, abrangendo a faixa de peso molecular de 150kDa para 3.5kDa. Um padrão de peso molecular (Colorburst, Sigma) também são mostrados em faixas 1 e 14. O gel mostrado aqui destaca a taxa de recuperação alta alcançada usando o sistema de 8100 GELFREE para fracionamento de proteínas. O gel mostrado aqui representa 4% da proteína recuperada de 200 mg.

Figura 1
Figura 1. Proteínas de fígado bovino homogeneizado separados usando o sistema de fracionamento GELFREE. 6 mL de cada fração 150 mL foi carregado e executado em um gel 1D PAGE SDS e corados de prata. Um padrão de peso molecular (MW) também foi carregado, conforme indicado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.

Discussion

O Sistema de Fracionamento GELFREE 8100 fornece um método rápido, simples e reprodutível para o particionamento de amostras de proteínas complexas em peso molecular baseados em frações discretas. Esse novo método de fracionamento elimina a necessidade de banda ou corte no local, tornando-se possível isolar proteínas em uma faixa ampla massa em 90 minutos. A capacidade de carregar quantidades relativamente grandes de amostra e recuperar frações em fase líquida é particularmente útil no isolamento e análise de proteínas de baixa abundância, que normalmente são mais difíceis de detectar. As frações resultantes podem então ser usados ​​em uma ampla gama de aplicações, tais como LC-MS, MALDI-TOF e immunoblotting.

Disclosures

Os autores deste artigo são empregados por Descoberta proteína que produz os reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida
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Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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