Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

Сопровождающее видео описывает использование GELFREE 8100 Фракционирование систему, какие разделы сложных образцов белка на основе молекулярного веса и восстанавливает фракций в жидкую фазу. Видео описывает, как работает технология, как она используется, а также предоставляет полученные данные, с полиакриламидном геле анализ фракционированного бычьего гомогената печени.

Abstract

GELFREE 8100 Фракционирование Система новую систему фракционирования белка предназначена для максимального восстановления белка во время молекулярного веса основаны фракционирования. Система состоит из одноразовых, 8-образец картриджи повышенной емкости и фракционирования настольный GELFREE инструмента. Во время разделения, постоянное напряжение между анодом и катодом водохранилищ и каждого белка смесь электрофоретически изгнаны из загрузки камеры в специально разработанный гель колонке геля. Белки концентрируются в тугой группу в концентрирующий гель, и обособляться в зависимости от их электрофоретической подвижности в решении геля. Как белка вымывается из колонки, они оказались в ловушке и концентрируется в жидкую фазу в сборной камере, без геля. Прибор остановилась через определенные промежутки времени, а фракции собранные с помощью пипетки. Этот процесс повторяется, пока все требуемые фракции были собраны. Если менее 8 образцов выполняются на картридж, неиспользованные камеры могут быть использованы в последующих увольнений.

Это новая технология обеспечивает быстрое и простое разделение до 8 сложных смесей белков одновременно, и имеет ряд преимуществ по сравнению с ранее доступными методами фракционирования. Эта система способна фракционирования до 1 мг общего белка на канал, в общей сложности 8 мг в картридже. Интактных белков в широком диапазоне масс разделены на основе молекулярной массой, сохраняя важные физико-химических свойств вещества. Жидкие фазы захвата обеспечивает высокую восстановления, устраняя необходимость группа или место резки, что делает процесс фракционирования высокой воспроизводимостью 1.

Protocol

1. Подготовка проб белка

  1. В 500 мкл трубки микроцентрифужную, объединить следующее:
Реагент Том, чтобы добавить:
* Белки образца (до 1 мг) До 112 мкл
Пример буфера (5X), представленные в комплект картриджей 30 мкл
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O х мкл в общей сложности выборка объемом 150 мкл **
  1. Денатурации образцов при 95 ° С в течение 5 минут. Остудить до комнатной температуры.

* Общее количество белка должны быть разделены, будет зависеть от сложности образца. Для более сложных образцов, таких как гомогената ткани, 150-200 мкг в канал рекомендуется.

** Если объем образца составляет менее 112 мкл, добавить 18 Ω H 2 O принести конечного объема до 150 мкл.

2. Загрузка GELFREE картридж

  1. Удалить GELFREE 8100 картридж из упаковки.
  2. Удаляют пластину герметик.
  3. Удалить хранения буфера из картриджа отсеки с помощью пипетки. Если все 8 палат картридж будет использоваться, картридж может быть обращено для слива хранения буфера из отсеков.
  4. Подготовка картриджа для загрузки, добавив GELFREE Запуск буфера на каждый из картриджей камеры следующим образом:
GELFREE патронника Объем GELFREE Запуск буфера, чтобы добавить
Анодный буфер водохранилище 8 мл
Катод буфера водохранилище 6 мл
Коллекция камер 100 мкл каждого
  1. Удаляют любые буфер из камеры загрузки образца.
  2. Нагрузка 150 мкл образцов в загрузке камеры использованием 8-канальная пипетка.
  3. Место загружены картридж в GELFREE 8100 Фракционирование станции. Нижний электрод массивы и закройте крышку.

3. Запуск картридж

  1. Использование сенсорного экрана с инструментом, нажмите метод кнопку, чтобы просмотреть список запрограммированных методов. Каждый из запрограммированных методов состоит из множества напряжения и повременной пауз, направленных на решение белков в определенном диапазоне молекулярных масс. GELFREE 8100 автоматически приостановит для фракции коллекцию с интервалами, указанными в методе.
  2. Как только соответствующий метод был идентифицирован, нажмите кнопку получить, и ввести номер нужного запрограммированных методом с помощью экранной клавиатуры. Нажмите OK, затем нажмите кнопку Применить. Метод, который был применен появится в нижней части главного экрана.
  3. Для выбора каналов (число выборок), который будет использован в перспективе, пресс кнопку канала на главном экране. Чтобы выбрать все восемь каналов, нажмите Выделить все. Затем нажмите кнопку Готово, чтобы вернуться к главному экрану.
  4. Убедитесь, что безопасность крышка закрыта, и что индикатор горит зеленым цветом в нижней части экрана.
  5. Для начала разделения белков, нажмите старт. Фракционирование станция будет автоматически паузы, когда пришло время собирать фракций. Примечание: В то время как система работает, круги показаны в окне слева сторону экрана изображают состояние каждого канала. Зеленый кружок означает, что канал является активным, желтый круг показывает, что прибор сделал паузу, и красный круг показывает, что канал не удалось. Напряжениях и токах, отображаются справа от круга состояния канала. Фракции должны быть удалены только когда статус круги пожелтели и текст сообщения, на экране появляется инструмент с.
  6. Для удаления фракций, откройте крышку прибора и использовать 8-канальный пипетки отозвать 150 мкл каждого из коллекции камер.
  7. После фракций были удалены, мыть сборной камеры дважды GELFREE Запуск буфера путем добавления 100 мкл на канал и пипетирования вверх и вниз в два раза.
  8. После мытья, добавьте 100 мкл из GELFREE Запуск буфера обратно в сборных камер, закройте крышку и нажмите кнопку Возобновить.
  9. GELFREE 8100 продлится до следующего интервала времени. Общее время оставшиеся в эксперименте показано на правой части экрана. Для переключения между оставшееся время, время прошло, и время паузы, нажмите кнопку выше окно, отображающее время.
  10. Как только все фракции были совместноllected, они могут сразу же быть использованы для подготовки далее вниз по течению, таких как изоэлектрической фокусировки или гель-электрофореза, или для анализа с использованием жидких масс-спектрометрии хроматографии или иммуноаффинной.

4. Представитель Результаты

200 мкг крупного рогатого гомогената печени была разделена на 12 фракций каждый, используя GELFREE системы фракционирования. 6 мкл каждой фракции работают на стандартные 1D SDS PAGE гель и серебра окрашены. Как показано на рисунке 1, белок образец фракционировали в 12 различных фракций, охватывающих диапазон молекулярного веса от 3.5kDa к 150kDa. Молекулярный вес стандартного (ColorBurst, Sigma) также показаны на дорожках 1 и 14. Гель показано здесь подчеркивается высокой скорости восстановления достигается с помощью GELFREE 8100 системы фракционирования белков. Гель показано здесь составляет 4% белка оправился от 200 мкг.

Рисунок 1
Рисунок 1. Белки из печени быка гомогената разделяются с помощью системы GELFREE Фракционирование 6. Мкл 150 мкл каждой фракции загрузки и запуска на 1D SDS PAGE гель и серебра окрашены. Молекулярный вес (МВт) стандарт был загружен, как указано. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Discussion

GELFREE 8100 Фракционирование Система обеспечивает быстрый, простой и воспроизводимый метод для разделения сложных образцов белков на отдельные молекулярной массой основе фракций. Этот новый метод фракционирования устраняет необходимость в группу или место резки, что позволяет изолировать белков в широком диапазоне масс в 90 минут. Возможность загрузки относительно большое количество образцов и восстановить фракций в жидкую фазу особенно полезно в изоляции и анализ низким обилием белков, которые обычно труднее обнаружить. В результате фракций может быть использован в широком спектре приложений, таких как LC-MS, MALDI-TOF и иммуноблоттинга.

Disclosures

Авторы этой статьи являются сотрудниками белка Discovery, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter