Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

İlişikteki video GELFREE 8100 Fraksiyonu Sistemi kullanımı, kompleks protein örneklerinin moleküler ağırlık bazında bölümleri açıklar ve sıvı faz fraksiyonları kurtarır. Video teknoloji, nasıl kullanılır, inşaat işleri ve fraksiyone sığır karaciğer Homojenat poliakrilamid jel elektroforezi analizleri ile ortaya çıkan veri sağlar.

Abstract

GELFREE 8100 Fraksiyonu Sistemi, molekül ağırlığı fraksiyonasyon sırasında protein kurtarma en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış olan yeni bir protein fraksiyonasyon sistemi. Bu sistem, tek kullanımlık, 8-örnek kapasiteli kartuşlar ve benchtop GELFREE Fraksiyonu Enstrüman oluşur. Ayrılması sırasında, anot ve katot rezervuarları arasında sabit bir gerilim uygulanır ve her protein karışımı elektroforetik bir yükleme bölmesine özel tasarlanmış jel kolon jel sürülür. Proteinler, bir yığın jel sıkı bir bant içine konsantre ve çözme jel kendi elektroforetik hareketlilik dayalı ayrılır. Proteinler sütun Zehir gibi, onlar toplama odasında jel sıkışıp kalmasına ve sıvı faz yoğunlaşmıştır. Cihaz sonra belirli zaman aralıklarında duraklatılmış ve kesirler bir pipet kullanılarak toplanan. İstenen tüm fraksiyonları toplanıncaya kadar bu işlem tekrarlanır. Az 8 örnek bir kartuş üzerinde çalışan varsa, kullanılmayan odaları sonraki ayrımlarında kullanılabilir.

Bu yeni bir teknoloji, aynı anda 8 kompleks protein karışımları kadar hızlı ve basit bir ayrımı kolaylaştırır ve daha önce mevcut fraksiyon yöntemleri kıyasla birçok avantaj sunar. Bu sistem kartuş başına 8mg toplam 1mg kadar kanal başına total protein fraksiyonasyon yeteneğine sahiptir. Geniş bir kütle aralığı içinde bozulmamış proteinler istinat analitin önemli fizikokimyasal özellikleri, molekül ağırlığı esasına göre ayrılır. 1 fraksiyonasyon süreci son derece tekrarlanabilir bant veya spot kesme ihtiyacını ortadan kaldırarak, sıvı faz tuzak yüksek iyileşme sağlar.

Protocol

1. Örnek Protein Hazırlık

  1. 500 ul mikrofuge'de tüp, aşağıdaki bir araya getirir:
Reaktif Eklemek için Cilt:
* Protein örneği (1 mg) 112 mcL
Kartuş kiti sağlanan örnek Tampon (5X) 30 mcL
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x 150μL örnek hacminin toplam mcL **
  1. Örnekleri 95 ° C'de 5 dakika denatüre. Oda sıcaklığında soğutun.

* Ayrılmış protein toplam miktarın örnek karmaşıklığına bağlı olacaktır. , Doku Homojenat gibi daha karmaşık örnekleri, için, kanal başına 150-200 mg tavsiye edilir .

Örnek hacmi 112 mcL az **, 150 mcL nihai hacmi getirmek için 18 Ω H 2 O ekleyin.

2. GELFREE Kartuş Yükleniyor

  1. GELFREE 8100 Kartuşu folyo poşetten çıkarın.
  2. Plaka macunu çıkarın ve atın.
  3. Bir pipet kullanarak kartuşu bölmesine depolama tampon çıkarın. Kartuş 8 odaları kullanılacaksa, kartuşu saklama bölmeleri tampon drenaj ters olabilir.
  4. Her kartuş odaları için aşağıdaki gibi GELFREE Koşu Tampon ekleyerek kartuşu yükleme için hazırlayın:
GELFREE Kartuş Odası Ses eklemek GELFREE Koşu Tampon
Anot tampon haznesi 8 mL
Katot tampon rezervuar 6 ml
Koleksiyon odaları Her biri 100 mcL
  1. Örnek bir yükleme bölmesine herhangi bir tampon çıkarıp atın.
  2. 8 kanallı pipet kullanarak yükleme odalarına 150 mcL örnekleri yükleyin.
  3. GELFREE 8100 Fraksiyonu Station içine yüklenen kartuş yerleştirin. Elektrot dizileri indirin ve kapağını kapatın.

3. Kartuş Koşu

  1. Cihazın dokunmatik ekran kullanarak, önceden programlanmış yöntemleri listesini görmek için yöntem düğmesine basın. Önceden programlanmış yöntemleri Her proteinlerin molekül ağırlıkları belirli bir aralık içinde çözmek için tasarlanmış belirlenen gerilimler ve zaman bazlı duraklar oluşur. GELFREE 8100 fraksiyon toplanması için yöntem belirtilen aralıklarla otomatik olarak ara.
  2. Uygun bir yöntem tespit edildikten sonra, geri alma tuşuna basın ve ekrandaki tuş takımını kullanarak istediğiniz önceden programlanmış bir yöntem numarasını girin . OK tuşuna basın, daha sonra uygula düğmesine basın. Uygulanan yöntem, ana ekranın alt kısmında görünecektir.
  3. Vadede kullanılacak kanallar (numune sayısı) seçmek için, ana ekranda kanal düğmesine basın. Sekiz kanal seçmek için, tümünü seç tuşuna basın. Daha sonra, ana ekrana dönmek için yapılan basın.
  4. Emniyet kapağı kapalı olduğundan emin olun ve gösterge ışığı ekranın altındaki yeşil olduğunu.
  5. Protein ayırma başlatmak için, start tuşuna basın. Kesirler Not toplamak için zamanı geldiğinde Fraksiyonu İstasyonu duraklama otomatik olarak sistem çalışırken, ekranın sol tarafındaki kutuya gösterilen çevreler her kanalın durumunu tasvir. Yeşil bir daire kanalı aktif olduğunu gösterir, sarı bir daire, enstrüman duraklatılmış olduğunu gösterir ve kırmızı bir daire kanalı başarısız olduğunu gösterir . Uygulanan gerilim ve akımların kanal durumu çevrelerin sağ görüntülenir. Durumunu çevrelerin açık sarı ve bir metin uyarı alet s ekranda göründüğünde Kesirler sadece çıkarılmalıdır.
  6. Kesirler kaldırmak için, cihazın kapağını açın ve toplama odalarının her birinden 150 mcL çekmek için 8 kanallı pipet kullanın.
  7. Kesirler çıkarıldıktan sonra, kanal başına 100 ul ekleyerek ve iki kez yukarı ve aşağı pipetleme GELFREE Koşu Tampon toplama haznesi iki kez yıkayın.
  8. Yıkadıktan sonra, toplama odalarına geri Tampon Koşu GELFREE 100uL ekleyin, kapağını kapatın, ve devam düğmesine basın .
  9. GELFREE 8100 sonraki zaman aralığı kadar sürecek. Deneyde kalan toplam süre ekranın sağ tarafında gösterilir. Kalan süre arasında geçiş yapmak için, bir süre geçtikten ve duraklama zamanı, zaman gösteren kutusunun üzerindeki düğmeye basın .
  10. Bir kere bütün fraksiyonlarının ortak olmuşturllected, hemen izoelektrik odaklama veya jel elektroforezi gibi daha fazla downstream hazırlanması, veya likit kromatografi kütle spektrometresi veya immünoafinite kullanarak analizi için kullanılan olabilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

GELFREE Fraksiyonu Sistemi kullanılarak, her birine 12 kesirler sığır karaciğer Homojenat 200 mg bölündü. Her fraksiyonu 6 mcL bir standart 1D SDS PAGE jel ve gümüş boyanan çalıştırıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, protein örneği 3.5kDa 150kDa için moleküler ağırlık aralığı kapsayan, 12 farklı fraksiyonları fraksiyone oldu. 1 ve 14 şeritli bir moleküler ağırlık standardı (ColorBurst Sigma) gösterilmiştir. Burada gösterilen jel protein fraksiyonasyon GELFREE 8100 sistemini kullanarak elde edilen yüksek iyileşme oranı vurgulamaktadır. Burada gösterilen 200 mg kurtarıldı protein jel% 4 oranında temsil eder.

Şekil 1
Şekil 1. Sığır karaciğer Proteinler GELFREE Fraksiyonu sistemi kullanılarak ayrılır Homojenat. Yüklenen her 150 mcL fraksiyonu 6 mcL ve 1D SDS PAGE jel ve gümüş boyanan çalıştırıldı. Belirtildiği gibi bir molekül ağırlığı (MW) standardı da yüklendi. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Discussion

GELFREE 8100 Fraksiyonu Sistemi ayrık molekül ağırlığı tabanlı kesirler karmaşık protein örneklerinin bölümleme için hızlı, basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Fraksiyonasyon Bu yeni bir yöntem sayesinde 90 dakika içinde geniş bir kütle aralığı üzerinde proteinleri izole etmek için, bant veya spot kesme ihtiyacını ortadan kaldırır. Örnek nispeten büyük miktarlarda yük ve sıvı faz fraksiyonları kurtarmak için tipik olarak algılanması daha zor olan düşük bolluk proteinler, izolasyonu ve analiz yeteneği yararlıdır. Ortaya çıkan kesirler sonra geniş bir uygulama dizisi, LC-MS, MALDI-TOF ve immunoblotting gibi kullanılabilir.

Disclosures

Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Protein Discovery bu makalenin yazarları tarafından istihdam edilmektedir.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter