Summary
ママはmagnetosome活性化に関与することが示されていたユニークなMagnetosome関連するタンパク質である。ここでは、からママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示
Abstract
走磁性細菌は、地磁気のフィールドに沿って自分自身をオリエンテーションすることができる水生微生物の多様なグループを構成。この動作は、適切な環境のための彼らの検索を支援するために考えられている
Protocol
1。 E.のママの遺伝子のクローニングと発現大腸菌
5' - GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG - 3'および5' - GCGCGGCAGCCATA - TGGCATACG - 3'：変異遺伝子mamAΔ41はプライマーと、Magnetospirillum magneticum AMB - 1のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅した。増幅したDNA断片では、NcoIサイトは、開始コドンATGで導入され、終止コドンは、ScoIサイトに置き換えられました。フラグメントをNcoIおよびSacIで消化し、pET52b（+）のそれぞれの部位にクローニングし、pET52bMamAΔ41- AMB1に上昇を与えていた。この構造では、mamAΔ41遺伝子は C末端の10 - Hisタグとインフレームで融合した。プラスミドは大腸菌BL21株にエレクトロポレートした。大腸菌はpET52bMamAΔ41を保有する菌株BL21 3時間アンピシリン（50 mg / ml）を310 ° Kを含む自動誘導（15）培地で増殖させた。培養温度は、310 °から300 ° Kにシフトし、300 ° Kでさらに48時間保持した細胞は、277℃で10分間K.ために5465グラムの遠心分離によって回収し8リットルの文化は、ウェット細胞ペレットの60グラムを作り出した。
2。バイオインフォマティクスの計算
分子量の計算（MW）、ProtParamサーバ（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）を使用して 、アミノ酸配列と280のタンパク質の1mg/1mlの予測吸収によると。 10His -タグMamAΔ41ためにMWの22529ダ（240アミノ酸）であり、MamAΔ41（トロンビンでHisタグ除去後に残った9個のアミノ酸を使用して）Mwは20596.5Da（187アミノ酸）である。 10His -タグMamAΔ41のための280の蛋白質の1mg/1mlの予測吸収は0.595であり、MamAΔ41ための0.579です。さらに、アミノ酸配列は、任意のシステイン残基が含まれていません。したがって、還元剤は、精製の過程で必要とされていません。
3。 MamAΔ41の精製
- イミダゾール（MW 228.2グラム/モル）4Mソリューションは、NaCl（分子量58.44グラム/モル）5M液、トリス - 塩酸（分子量121.3グラム/モル：ストック溶液の調製のために、以下の濃度で（各200ml）をし、検量すると準備）1M溶液、pH = 8に調整する。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて蒸留水（DDW）とミックスを追加。 0.22μmフィルタと室温で維持するとフィルターソリューション。
- ストック溶液（表1）から6新鮮なバッファーを調製し、フィルタリング。
- 1:2の比率、バッファのボリュームへの細胞のグラム（ml）にバッファーで細胞を希釈して一時停止。
- サンプル中のDNA断片を打開するためにDNアーゼI（1 mg / ml）をの細菌の各10grに対して10μlを追加します。 EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルの細菌の各20grのために1ミリリットルを追加。氷上で20分間インキュベートする。
- 25000 psiでフレンチプレスの2つのサイクルで細胞を破壊した。超音波処理とは異なり、フレンチプレスは薄いオリフィスを介して高圧下で細胞を強制することにより、大量（> 10ml）を細胞の押し出しを対象としています。ピストンは、その使用方法と温度の蓄積に起因する組み立てに先立って10分間氷上で冷却する必要があります。
- 25ミリリットル超遠心チューブに溶解した細胞を移し、サンプルがチューブのネックラインに達するまで、バッファで（50mgの）正確にそれらのバランスをとる。
- 277で1時間27万グラム゜Kでの超遠心分離によって別々の細胞の破片
- カラムに20％エタノールで維持されているニッケルNTA樹脂、、4mlを加えることによって自家製重力ニッケルNTAカラム（2.5センチメートル直径）を準備する。完全流体のドロップを聞かせ、その後、DDW 40mlで洗浄し、完全に液滴をしましょう。緩衝液A 40mlでカラムで予め平衡化樹脂
- 重力ニッケルNTAカラム上での超遠心分離管から可溶性画分を適用します。フロースルーを収集する（非結合タンパク質）と277Kでの保持、流体ドロップしてみましょう。
- ペレットをスクラップする小さなヒントを使用して超遠心管からペレットのサンプルを収集する。 2x SDS - PAGEサンプルバッファーで5％β-メルカプトエタノール50μlので先端を混ぜる。
- フロースルーを収集し、277Kで保持する、流体のドロップレット100ミリリットル緩衝液Bでカラムを洗浄。
- 15マークエッペンドルフチューブ（1.5ミリリットル）を準備する。
- 溶出 - 近い列のバルブとしてカラムにバッファーCの1mlをロードし、バルブ開度とフロースルーコレクションに続いて3分間インキュベートする。このステップを3回繰り返します。
- 1 mlのバッファーC刻みでサスペンションの残りの部分を溶出し、バルブを閉じます。
- フラクションの280nmでのODを測定し、タンパク質のピークの位置を評価し、ODはまだ> 0.3の場合は、追加のサンプルが必要である。
- 集めた画分のSDS - PAGE分析。このような分析は、フロースルーとu洗い、以下のサンプルは、非結合タンパク質のフロースルーでも実行する必要がありますLTRA -遠心ペレットのサンプル。 2x SDS - PAGEサンプルバッファーで5％β-メルカプトエタノールの10μlを、各サンプルから10μlを混ぜる。 15％SDS - PAGEでサンプルをロードし、180ボルトで45分間実行する。
- InstantBlueの溶液15mlでゲルを染色し、1時間振とうする。プラスチックの箱がカバーし、光から保護されていることを確認します。
- ゲルを評価する。タンパク質の発現を示すバンドに応じて高いと、特定の場合は、選択された溶出画分をマージする。
- 10 - Hisタグを除去するために、混合サンプルの製造業者の勧告によると、ウシトロンビン（10ユニット/μl）、1mgのタンパク質あたり10μlのトロンビンを追加。
- 透析は、過剰なイミダゾールの除去のために使用されており、イオン交換結合時に必要なレベルのNaCl濃度を減少させる。透析の場合は、7 kDの分子量の所望の長さをカット（MWCO）透析チューブを切断。 DDWで洗い、一方の端（またはクリップでシール）で結び目を作る。上部にあるスペースを残しながら、袋の上にマージされたタンパク質溶液を移し、最大クランプ。
- 4リットルチルド透析バッファーに浸す透析チューブ（バッファーD）。 277でゆっくり一晩ソリューションをかき混ぜる゜K
- 、ビーカーの透析チューブを取り出し、小さなカットを行うと50mlのチューブにタンパク質を転送する。
- イオン交換クロマトグラフィー：高速液体クロマトグラフィー（FPLC）のプレパックMonoQ 4.6/100 PEのカラムを組み立てる。 DDWろ過された水の5カラム体積（CV）でカラムを洗浄。バッファDの5 CVで平衡化したカラム
- DDW（2つのループのボリューム）で注入ループを洗浄し、注入ループのタンパク質をロードバッファーDで繰り返す。
- タンパク質試料（1ml /分の流量）を注入し、無制限蛋白質のSDS - PAGEの検出のための分画の収集を開始します。
- 全体のサンプルをカラムにロードされるまで、初期のタンパク質の量（ステップ3.23）、ループを洗浄せずに、注入ループ、繰り返し手順3.25から3.26より大きい場合。
- 無限のタンパク質を除去するために、緩衝液Cの3 CVでカラムを洗浄します。
- 高流量があるのはコストで使用することができますがバッファD＆E（100％緩衝液Eはグラデーションの終点である場合）、流速1ml /分（40〜2000ミリメートルNaClの60分直線勾配でタンパク質を溶出する大きなボリュームが、あまり集中、タンパク質のピーク）。彼らは280nmのクロマトグラムに表示される蛋白質のピークを収集する。
- 勧告を製造するに従ってプレパックカラムを清掃してください。
- 集めた画分のSDS - PAGE分析。このような分析は、限りないタンパク質のフロースルーとタンパク質のピークフロースルー、以下のサンプルで実行する必要があります。 SDS - PAGEを実行し、ステップ3.17から3.18に言及として染色。
- タンパク質プリステンドマーカーに応じて予測分子量でタンパク質バンドの存在のためのゲルを評価する。関連するタンパク質を含む、選択した溶出画分をマージ。
- サイズ排除クロマトグラフィーのために必要なNaCl濃度を下げるために、マージされたサンプルを透析する。としてバッファF.に対してステップ3.21から3.23に記載されている透析を行います
- テーブルの遠心でVivaspin - 15 10,000 MWCO〜8 mg / mlの、4000rpmのを使って蛋白質試料を集中する。石英キュベットに、280nmでのODを測定することによって、欲望の濃度を検証する。蛋白質があまりにも集中している場合、バッファFでそれを希釈し、再度測定する。
- サイズ排除プレパックカラム、FPLCでHiLoad 60分の26スーパーデックス200を、組み立てる。DDWろ過された水の3 CVでカラムを洗浄。バッファF.の3 CVで平衡化したカラム
- 注入ループのタンパク質サンプルのない以上4mlをロードしないバッファF.と同じボリュームに続いて5ミリリットルDDW（2つのループボリューム）を注入ループを洗ってください。
- タンパク質試料（3.5 ml /分の流量）を注入し、彼らはそれを280グラム表示される蛋白質のピーク分画の収集を開始します。それは、カラム容積に達するまで、バッファフローをしましょう。
- 全体のサンプルをカラムにロードされるまで、初期のタンパク質の量（ステップ3.23）、ループを洗浄せずに、注入ループ、繰り返し手順3.25から3.26より大きい場合。
- 製造勧告に準拠したプレパックカラムを清掃してください。
- 集めた画分のSDS - PAGE分析。このような分析は、タンパク質のピークのサンプルを実行する必要があります。 SDS - PAGEを実行し、ステップ3.17から3.18に言及として染色。
- ゲルを評価する：蛋白質のピークが固有である場合、正しい予測分子量でタンパク質プレステインドマーカーおよび1バンドのみに基づいて、関連するタンパク質の溶出分画を選択したマージ表示されます。
- テーブルの遠心で> 20 mg / mlの、4000rpmのにVivaspin - 15 10,000 MWCOを用いてタンパク質サンプルを集中する。 280nmでのODを測定することによって、欲望の濃度を検証する。精製MamAΔ41は、結晶化のための26.5 mg / mlに濃縮した。 <LI>マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI - TOF）を用いて、サンプルの純度とタンパク質の同定を確認してください。
- タンパク質は、質量分析計とSDS - PAGEによると、精製されている場合は、事前にマークエッペンドルフチューブに集中MamAΔ41を分割し、それぞれの25 -50μlのタンパク質。
- フラッシュは193゜Kで液体窒素や店舗で凍結
4。代表的な結果
このプロトコルが正しく行われているときに一高度に精製された、サイズが均一で濃縮タンパク質のサンプルを取得する必要があります。これらのタンパク質試料は、結晶化の試験のためだけでなく、酵素の動力学、結合親和性など多くの生化学的研究、その後、準備が整いました。精製プロトコールの主な手順の代表的な結果は、ここで説明する。 Ni - NTAアフィニティーカラムの溶出プロファイルのSDS - PAGE分析では、〜22kDa（図1）の適切なMWで可溶性画分に発現したタンパク質を介して非常に明らかにする必要があります。フロースルー無限のタンパク質の任意のタンパク質は、フロースルーをし、超遠心ペレットのサンプル洗う場合は、このSDS - PAGE分析には、最小値を明らかにする必要があります。適切なタンパク質の大規模なバンドが、これらのサンプルに表示されない場合、1つは、間違ったバッファー調製、細胞破壊や文化の自動誘導条件と成長の問題の問題を考慮する必要があります。
イオン交換クロマトグラフィーは、ニッケル樹脂（静電的相互作用またはヒスチジン/負のアミノ酸が豊富なタンパク質のループによる）とノーカットHisタグ-望ましい蛋白質に結合された他の大腸菌のタンパク質に私達の望ましいタンパク質との間に区別するために予備成形されています。このコラムでは、増加するNaCl濃度下で正に帯電した樹脂への結合親和性に係るタンパク質を分離する。高度に負に帯電したタンパク質は負に帯電したものを緩和するために並べるより高いNaCl濃度で溶出されます。このコラムの利点は、高流量との結合能力があります。イオン交換クロマトグラム（図2）増加するNaCl濃度の3タンパク質の集団間の良好な分離を明らかにする。 SDS - PAGE分析は、さらなる精製工程が必要かどうかを望ましいものと評価を分離し、各集団のMWを決定するために必要とされる。第2の集団は、ウシトロンビンで切断されたとサード人口が低濃度のため、SDS - PAGEで検出不可能であるされていないMamAΔ41+ Hisタグ（〜22kDa）でありながら、最初の人口はMamAΔ41（〜20 kDaの）です。タンパク質のピークが明確に分離されていない場合、1つは、間違ってバッファの準備を考慮するまたはNaClの勾配のスロープを変更してください。
サイズ排除クロマトグラフィーは、Ni - NTAレジンにバインドされていたし、イオン交換クロマトグラフィー中に分離されていない他の大腸菌の細胞の蛋白質への私達の望ましいタンパク質との間に区別するために予備成形されています。この列には、その大きさに応じてタンパク質を分離する。大規模なタンパク質は、より大容量で溶出される小規模なものとは対照的に小さい溶出容量で溶出されます。カラムクロマトグラム（図3）は、1つの主要な人口として望ましい蛋白質の良好な分離を明らかにする。人口は〜20kDaの分子量と適切なモノマーの大きさに溶出するが表示されます。 〜80 kDaのバンド（Ni - NTAレジンを結合する大腸菌典型的なタンパク質）の存在は、列の読み込み前にSDS - PAGEで検出し、この実行中に消えています。この〜80kDaのタンパク質の濃度がそもそも低いため、その人口はその希釈のため、クロマトグラムに表示されず、SDS - PAGE分析は、精製の効率を決定するために必要とされる。一つ確実に適切なMWに純粋なタンパク質の存在を決定することができたので、我々は、SDS - PAGEにメインピークの希釈と濃縮サンプルをロードすることをお勧めします。この段階で蛋白質が精製され、その均質性は、MALDI - TOFによって評価されるべきである。この分析では、10176ダ（図4）のMwの20347 Daと、別のMWのタンパク質を明らかにした。 〜10 kDaの蛋白質は、〜20 kDaのタンパク質が充電さ倍増です。 Hisタグの除去後に残った9個のアミノ酸とMamAΔ41の予測MWは20596.5達だった。得られるMALDI - TOF MWと比較することで、我々は、彼らが離れて248打であることがわかった。この相違は、最初のメチオニンの一般的な劣化と第二グリシンによるMALDI - TOFの測定誤差および/またはに起因することができます。結論として、タンパク質は高度に精製され、さらなる実験に使用することができます。
表1。バッファ製剤。
図1。 Ni - NTAカラムで精製の 代表的なSDS - PAGE分析右から左へ、。P -超遠心ペレット（3.11プロトコルのステップ）、W -ウォッシュ（3.12プロトコルのステップ）、U -無限のタンパク質（3.10プロトコルのステップ）、E -溶出SAMP五車線LES（3.14プロトコルのステップ）、M - タンパク質マーカー（数字はMWを示す）。矢印はMamAΔ41を示している。
図2。イオン交換クロマトグラフィー工程 （a）イオン交換（MonoQカラム）クロマトグラムの分析は 、ブルー-集めた画分の表示-吸収280、タンパク質濃度、グリーン- NaCl濃度、赤を表します。イオン交換精製工程の（b）の代表SDS - PAGE分析。左から右へ、M - タンパク質マーカー（数字は分子量を示す）、A6 - 最初のピーク分画、A8 -番目のピークの割合。
図3。サイズ排除クロマトグラフィーの分析 （）サイズ排除（Superdex 200カラム）クロマトグラム、青-吸収280nmのは、タンパク質濃度、集めた画分の赤指標を表します。サイズ排除精製ステップの（b）の代表SDS - PAGE分析。左から右へ、M -タンパク質マーカー（数字は、MWを示す）、PreI -プリ注入サンプル、最初のピーク、ピークから収集されたA4 - 6D -希薄化後画分から収集したA4 - 6複合割合。
図4。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI - TOF）精製MamAΔ41の質量スペクトル。行列はシナピン酸（SA）です。 MamAΔ41もMamAΔ41の2倍の荷電種が10176ダにあるように、20347でDaを示した。
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Discussion
タンパク質の精製は、任意のタンパク質生化学的または構造的な研究の主要なステップです。それぞれの蛋白質がそれ自身の動作と一意であるため、人はそのプロパティを定義し、それに応じてその精製を変更する必要があります。蛋白質のターゲットは、バイオインフォマティクスのツールを使用して精製するための第一歩として分析する必要があります。彼らは、環境と特殊なイオン/配位子の必要性を減らす/酸化性の必要性を評価し、目標等電点を計算するために使用されています。ターゲットの一意性を反映して我々のプロトコルのいくつかの重要な変更があります。これらの変更は、バッファ、動作温度とカラムの調整が含まれています。
最初の重要な変更は、使用中のバッファである（3.3節）このようなバッファは、正しいpH範囲、イオン/リガンドとタンパク質の安定性や機能に必要なイオン強度を反映するように変更する必要があります。ターゲットが不安定の兆候（劣化、降水量や機能の損失）を示す場合、1つは、テストおよび他のより適切なバッファを検索する必要があります。別の重大な問題は、精製のスピードと動作温度です。タンパク質分解（プロテアーゼまたはタンパク質内部の不安定性に起因する）を回避する手段として急速な浄化は277で実行してください° K（コールドバッファ、ローターと列の使用を含む）。
アフィニティー精製のステップだけでなく、他のクロマトグラフィーの段階では、様々な樹脂のソースで実行することができます。アフィニティー樹脂は、タンパク質のいくつかのテクニックを使用してロードすることができ、それがローカル設定に基づいて変更する必要があります。樹脂が上にタンパク質溶液を渡すことでロードされている場合、片方が最大タンパク質の捕捉を確実に遅い流れを（1〜1.5ミリリットル/分）を使用する必要があります。バッチの結合（タンパク質溶液と樹脂を混合）は、1つは277で、室温と長く（最大1時間）で約10分間のインキュベーションを許可する必要がある゜K親和性の強さに基づいて、樹脂の洗浄は、様々なイミダゾール濃度下で行うことができる。
全体的に、このプロトコルの各ステップの変化は考慮してガイドとして、この精製スキームを取って効率的にユニークな蛋白質のターゲットを精製するために行われるべきである。
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Acknowledgments
我々は、彼らのアドバイスやコメントのための彼のサポートとGeula Davidov、ノームGrimbergと陳グットマンのために博士アミールAharoniを認めます。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| French Press | Equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius AG | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher Scientific | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
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