Summary
Mamma är en unik Magnetosome tillhörande protein som visade sig vara involverad i magnetosome aktivering. Här presenterar vi rening protokollet för Mama radering mutant (MamAΔ41) från
Abstract
Magnetotactic bakterier utgör en mångskiftande grupp vattenlevande mikroorganismer som har möjlighet att orientera sig längs geomagnetiska fält. Detta beteende tros Stödet sitt sökande efter lämpliga miljöer
Protocol
1. Kloning och uttryck mama Gene i E. coli
Den muterade genen mamAΔ41 förstärktes med polymeraskedjereaktion (PCR) från genomiska DNA Magnetospirillum magneticum AMB-1, med grundfärg: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'och 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3 ". I den förstärkta DNA-fragment, var en NcoI plats infördes i början kodon ATG och uppsägning kodon ersattes med en ScoI webbplats. Fragmenten var kokas med NcoI och SACI och klonade i respektive platser i pET52b (+), som ger upphov till pET52bMamAΔ41-AMB1. I denna konstruktion var mamAΔ41 genen smält i-ram med 10-Hans tag på C-terminus. Den plasmid var electroporated i E. coli-stam BL21. E. coli stam BL21 hyser pET52bMamAΔ41 odlades i autoinduktion (15) medium som innehåller ampicillin (50 mg / ml) 310 ° K i 3 timmar. Odlingen Temperaturen var då flyttats från 310 ° till 300 ° K och bibehållas under ytterligare 48 timmar vid 300 ° K. Cellerna skördades genom centrifugering vid 5465g i 10 min vid 277 ° K. 8 liter kultur produceras 60 gram våt cellpelleten.
2. Bioinformatik Beräkningar
Beräkningar av molekylvikt (MW), enligt aminosyror sekvens och den förväntade absorption av 1mg/1ml av protein i 280 nm, med hjälp av ProtParam servern (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). För 10His-Tag-MamAΔ41 MW är 22.529 Da (240 aminosyror) och för MamAΔ41 (med 9 aminosyror kvar efter His-taggen borttagning av trombin) i MW 20596.5Da (187 aminosyror). Den förutspådda absorption av 1mg/1ml av protein i 280 nm för 10His-Tag-MamAΔ41 är 0,595 och för MamAΔ41 är 0,579. Dessutom innehåller den aminosyrasekvens inga cystein rester. Därför är reduktionsmedel krävs inte under reningsprocessen.
3. Rening av MamAΔ41
- För stamlösning beredning, väg upp och förbereda (200 ml vardera) i följande koncentrationer: Imidazol (MW 228,2 g / mol) 4M lösning, NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M lösning, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol ) 1M lösning, justera pH = 8. Tillsätt dubbla destillerat vatten (DDW) och blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar. Filter lösningar med 0.22μm filter och förvara i rumstemperatur.
- Förbered och filtrera 6 färska buffertar från stamlösningar (tabell 1).
- Späd och avbryta celler i buffert A i förhållandet 1:2, till gram av celler buffert volym (ml).
- Tillsätt 10μl för varje 10gr av bakterier i DNase I (1 mg / ml) för att bryta DNA i provet. Tillsätt 1 ml för varje 20gr av bakterier av EDTA gratis proteashämmare cocktail. Inkubera i 20 minuter på is.
- Störd celler av två cykler av franska pressen på 25.000 psi. Till skillnad från ultraljudsbehandling, är den franska pressen som syftar till hög volym (> 10 ml) cell extrudering genom att tvinga de celler under högt tryck genom en smal öppning. Kolven ska kylas på is i tio minuter innan dess användning och montering på grund av temperatur uppbyggd.
- Överför lyserade celler till 25ml ultracentrifugen rör och balansera dem exakt (50 mg) med buffert A tills provet når röret s nacken.
- Separata cellfragment av Ultra centrifugering vid 270 tusen gi 1 timme vid 277 ° K.
- Förbered en hemmagjord gravitation Ni NTA kolumn (2,5 cm diameter) genom att lägga till 4 ml Ni NTA harts, som bevarar i 20% etanol, på kolonnen. Låt vätskan släppa helt, tvätta sedan med 40 ml DDW och låt vätskan sjunka helt. Pre-jämvikt hartset i kolumnen med 40 ml buffert A.
- Applicera fraktionen från ultra-centrifugering rören på allvaret Ni NTA kolumn. Låt vätskan sjunka, samla genomströmning (obundet proteiner) och bevarar på 277K.
- Samla pellets prov från ultra-centrifugeras rören med hjälp av en liten spets att skrota pelleten. Blanda spetsen i 50μl av 5% β-merkaptoetanol med 2X SDS-PAGE prov buffert.
- Tvätta kolonnen med 100 ml buffert B. Låt vätskan sjunka, samla genomströmning och bevara på 277K.
- Förbered 15 märkt Eppendorf-rör (1,5 ml).
- Eluering - Stäng kolumnen ventilen och sedan ladda 1 ml buffert C kolonnen, inkubera i 3 min följt av ventilen öppna och flöde-genom insamling. Upprepa detta steg tre gånger.
- Eluera resten av fjädring, 1 ml buffert C steg och stänga ventilen.
- Mät OD vid 280 nm av de fraktioner och utvärdera placeringen av proteinet toppen, om OD fortfarande är> 0,3, är ytterligare prover behövs.
- SDS-PAGE analys av insamlade fraktioner. Sådana analyser bör utföras även med följande prover, obundna proteiner genomströmning, tvätta genomströmning och uLTRA-centrifugering pellets prov. Blanda 10μl från varje prov med 10μl av 5% β-merkaptoetanol med 2X SDS-PAGE prov buffert. Ladda prover på 15% SDS-PAGE och springa i 45 minuter i 180 volt.
- Färga gelen i 15 ml InstantBlue lösning, skaka i 1 timme. Se till att plastlådan är täckt och skyddad mot ljus.
- Utvärdera gel, om protein uttryck är hög och specifik Enligt den preliminära band, slå samman utvalda eluerade fraktioner.
- För att ta bort 10-Hans-tagg, lägg bovint trombin (10 enheter / l), 10μl trombin per 1 mg protein, enligt tillverkarens rekommendation till den kombinerade prov.
- Dialys används för överskott Imidazol bortforsling och minska NaCl koncentrationer för nivåer som behövs under jonbyte bindande. För dialys, skär önskad längd av 7 kD molekylvikt avskurna (MWCO) dialys slang. Tvätta med DDW och gör en knut i ena änden (eller tätning med clips). Överför samman protein lösningen på påsen medan utrymme längst upp och klämma upp.
- Sänk ner dialys slangen i 4 liter kylt dialys buffert (buffert D). Rör lösningen långsamt över natten på 277 ° K.
- Ta ut dialys slangen i bägaren, gör ett litet snitt och överföra protein för 50ml rör.
- Jonbyteskromotografi: montera färdigförpackade MonoQ 4.6/100 PE kolumnen Snabb vätskekromatografi (FPLC). Tvätta kolonnen med 5 kolumn volymer (CV) DDW filtrerat vatten. Jämvikt kolonnen med 5 CV buffert D.
- Tvätta injektionsslinga med DDW (två loop volymer) och upprepa med buffert D. Lägg protein i injektionsslinga.
- Injicera protein prov (flöde på 1 ml / min) och börja samla fraktioner för SDS-PAGE detektering av gränslösa proteiner.
- Om den första proteinet volym (steg 3,23) är större än injektionsslinga, upprepa steg från 3,25 till 3,26, utan att tvätta slingan, tills hela provet lastas på kolumn.
- Tvätta kolonnen med 3 CV buffert C för att avlägsna obundna proteiner.
- Eluera protein med 60 min linjär övertoning på 40 2000mm NaCl mellan buffertar D & E (när 100% buffert E är i slutet av lutning), flöde 1 ml / min (även om högre flöden kan användas i kostnaderna för större volymer, men mindre koncentrerad, toppar protein). Samla proteiner toppar som de visas i 280 nm kromatogrammet.
- Rengör färdigförpackade kolonnen enligt tillverka rekommendation.
- SDS-PAGE analys av insamlade fraktioner. Sådana analyser bör utföras med följande prover, gränslösa proteiner genomströmning och protein toppar genomströmning. Kör SDS-PAGE och fläck som nämns i steg från 3,17 till 3,18.
- Utvärdera gel för protein band som finns vid den förutspådde Mw enligt proteinet före färgade markör. Sammanfoga markerade eluering fraktioner som innehåller de relevanta protein.
- Dialyze sammanslagna prover, för att sänka NaCl koncentrationer som behövs för storlek uteslutning kromatografi. Utför dialys som nämns i steg från 3,21 till 3,23 mot buffert F.
- Koncentrera protein provet med en Vivaspin-15 10 tusen MWCO till 8 mg / ml i en tabell centrifug, 4000 rpm. Bekräfta önskan koncentration genom att mäta OD vid 280 nm i kvarts kyvett. Om proteinet är för koncentrerad späda ut det med buffert F och mäta igen.
- Montera storlek utanförskap färdigförpackade kolumnen HiLoad 26/60 Superdex 200, på FPLC, Tvätta kolonnen med 3 CV DDW filtrerat vatten. Jämvikt kolonnen med 3 CV buffert F.
- Tvätta injektionsslinga med 5ml DDW (två loop volymer) följt av samma volym med buffert F. Lägg inte i mer än 4 ml av protein provet i injektionsslinga.
- Injicera protein prov (flöde på 3,5 ml / min) och börja samla proteiner topp fraktioner som de ser det 280 nm kromatogrammet. Låt bufferten flöda tills den når kolonnen volym.
- Om den första proteinet volym (steg 3,23) är större än injektionsslinga, upprepa steg från 3,25 till 3,26, utan att tvätta slingan, tills hela provet lastas på kolumn.
- Rengör färdigförpackade kolonn enligt tillverka rekommendation.
- SDS-PAGE analys av insamlade fraktioner. Sådana analyser bör utföras med proteinet toppar prover. Kör SDS-PAGE och fläck som nämns i steg från 3,17 till 3,18.
- Utvärdera gel: om protein toppar är specifika i den förutspådda rätt Mw enligt proteinet före färgade markör och endast ett band är synlig slå samman utvalda eluerat fraktioner av relevant protein.
- Koncentrera protein provet med en Vivaspin-15 10 tusen MWCO till> 20 mg / ml i en tabell centrifug, 4000 rpm. Bekräfta önskan koncentration genom att mäta OD vid 280 nm. Det renade MamAΔ41 var då koncentrerad till 26,5 mg / ml för kristallisering. <li> Bekräfta prov renhet och protein identifiering med hjälp av Matrix-assisterad laser desorption / jonisering (MALDI-TOF).
- Om proteinet renas enligt masspektrometer och SDS-PAGE, dela den koncentrerade MamAΔ41 till redan märkt Eppendorf-rör, 25-50μl protein i varje.
- Flash frysta i flytande kväve och förvara vid 193 ° K.
4. Representativa resultat
När protokollet är gjort på rätt sätt ska man få renat, storlek homogen och koncentrerad protein prover. Dessa protein prover sedan redo för kristallisering prövningar samt biokemiska studier, såsom enzymkinetik, affinitet och mer. Som beskrivs här är representativa resultat av de viktigaste stegen i reningen protokollet. SDS-PAGE analys av eluering profil Ni-NTA affinitet kolumnen bör avslöja mycket mer än uttryckt proteinet i den lösliga fraktionen vid lämpliga MW ~ 22kDa (Figur 1). Detta SDS-PAGE analys bör också avslöja minsta om något protein i gränslös proteiner genomströmning, tvätta genomströmning och ultra-centrifugering pellets prov. Om stora band av lämplig proteinet finns med i dessa prover man bör överväga fel buffert förberedelser, problem i cell störningar eller problem i kultur autoinduktion villkor och tillväxt.
Jonbyteskromatografi sker ofta för att skilja mellan våra önskvärt protein till andra E.coli proteiner som var bundna till nickel harts (på grund av elektrostatisk interaktioner eller histidin / negativ aminosyror rika loopar protein) och oslipade Hans-märkta önskvärda protein. Denna kolumn separerar proteiner enligt deras affinitet till positivt laddade harts under ökande NaCl koncentrationer. Mycket negativt laddade proteinet kommer eluera i högre NaCl koncentrationer appose till måttligt negativt laddade sådana. Fördelarna med denna kolumn är högt flöde och bindande förmåga. Den jonbyte kromatogram (figur 2) visar en god separation mellan 3 proteiner populationer i ökande NaCl koncentration. SDS-PAGE analys behövs för att avgöra MW varje population, isolera önskvärt en och utvärdering huruvida ytterligare reningssteg behövs. Den första befolkningen är MamAΔ41 (~ 20 kDa), medan den andra befolkningen MamAΔ41 + Hans Tag (~ 22kDa) som inte klyvs av bovint trombin och den tredje befolkningen är omöjligt att spåra i SDS-PAGE på grund av låg koncentration. Om proteiner toppar inte är klart åtskilda en bör överväga fel buffert förberedelse eller ändra lutningen på NaCl lutning.
Storlek utanförskap kromatografi sker ofta för att skilja mellan våra önskvärt protein till andra E.coli cell proteiner som var bundna till Ni-NTA harts och inte separeras under jonbyteskromatografi. Denna kolumn separerar proteiner beroende på deras storlek. Stora proteiner kommer eluera i mindre elutionsvolymerna motsats till små som kommer att elueras i större volymer. Kolumnen kromatogram (Figur 3) visar en god separation av de önskvärda proteinet som en majoritetsbefolkningen. Befolkningen tycks eluera i lämpliga monomer storlek med en MW ~ 20 kDa. Förekomsten av ~ 80 kDa-bandet (E. coli typiskt protein som binder Ni-NTA harts) upptäcks i SDS-PAGE före kolumn lastning och försvinner under denna körning. Eftersom koncentrationen av denna ~ 80 kDa protein är låg till att börja med, verkar dess befolkning inte i kromatogrammet på grund av dess utspädning och SDS-PAGE analys behövs för att bestämma Reningseffekten. Vi rekommenderar att läsa in en utspädd och koncentrerad urval av de viktigaste topp till SDS-PAGE så man kan säkert fastställa förekomsten av ett rent protein i rätt MW. Vid det här laget proteinet renas och homogenitet bör utvärderas av MALDI-TOF. Denna analys visade ett protein i MW 20.347 Da och en annan i MW 10.176 Da (Figur 4). Den ~ 10 kDa protein som är ~ 20 kDa protein fördubblats debiteras. Den förutspådda MW MamAΔ41 med 9 aminosyror kvar efter Hans-Tag bort var 20596,5 Da. Genom att jämföra det erhållna MALDI-TOF-MW fann vi att de är 248 Da isär. Denna olikhet kan bero på MALDI-TOF mätfel och / eller på grund av gemensamma nedbrytning av den första metionin och den andra glycin. Avslutningsvis är det protein renat och kan användas för vidare experiment.
Tabell 1. Buffert formuleringar.
Figur 1. Representant SDS-PAGE analys av Ni-NTA kolumnen rening från höger till vänster,. P-ultra-centrifug pellet (3,11 protokoll steg), W-tvätt (3,12 protokoll steg), U-gränslösa proteiner (3,10 protokoll steg), E- fem gränderna i eluering provtagning och analyserLes (3,14 protokoll steg), M - protein markör (siffrorna visar MW). Pil anger MamAΔ41.
Figur 2. Analys av jonbyteskromatografi steg (a) Jonbyte (MonoQ spalten) kromatogram, Blå - absorption 280 nm, representerar proteinkoncentration, Green-NaCl koncentration, Röd - indikation på insamlade fraktioner. (B) Representativa SDS-PAGE analys av jonbyte reningssteget. Från vänster till höger, M - protein markör (siffrorna visar MW), A6 - första toppen fraktion, A8-andra toppen fraktionen.
Figur 3. Storlek uteslutning kromatografi analys (en) Storlek utslagning (Superdex 200 spalten) kromatogram, Blå - absorption 280 nm, representerar proteinkoncentration, Red indikation på insamlade fraktioner. (B) Representativa SDS-PAGE analys av storleken utanförskap reningssteg. Från vänster till höger, M-protein markör (siffrorna visar MW), Prei-pre-injicerade provet, A4-6 tillsammans fraktion som samlas in från den första toppen, A4-6D-utspädning fraktion som samlas in från toppen.
Figur 4. Matrix-assisterad laser desorption / jonisering (MALDI-TOF) masspektrum av renat MamAΔ41. Matrisen är Sinapic syra (SA). MamAΔ41 visas på 20.347 Da, som också visas är dubbelt laddade arter av MamAΔ41 på 10.176 Da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein rening är det viktigaste steget i alla proteiner biokemiska eller strukturella studier. Eftersom varje protein är unik med sitt eget beteende måste man definiera dess egenskaper och ändra dess rening därefter. Protein mål bör analyseras som ett första steg mot rening med hjälp av bioinformatiska verktyg. De används för att beräkna målet iso-elektriska punkten, bedöma behovet av att minska / oxiderande miljön och dess behov av speciella joner / ligander. Det finns flera viktiga ändringar av våra protokoll som speglar målet unika. Dessa ändringar omfattar buffert, arbetstemperaturer och justeringar kolumn.
Den första kritiska ändring är den buffert som används (avsnitt 3.3) en sådan buffert behöver ändras för att spegla det korrekta pH-intervall, joner / ligander och jonstyrka som behövs för protein stabilitet och funktioner. Om målet visar några tecken på instabilitet (nedbrytning, utfällning eller förlust av funktion) ett behov av att testa och söka efter andra mer lämpliga buffertar. En annan kritisk fråga är rening hastighet och arbetstemperaturer. Som ett sätt att undvika proteinnedbrytning (på grund av proteaser eller protein inre instabilitet) snabb rening bör utföras vid 277 ° K (inklusive användningen av kalla buffertar, rotorer och kolumner).
Affinity reningssteg samt andra stadier kromatografi kan utföra på olika harts källor. Affinity kåda kan protein laddas med hjälp av flera tekniker och det bör ändras utifrån lokala inställningar. Om harts laddas genom att skicka proteinet lösningen över det, bör man använda långsamt flöde (1-1,5 ml / min) för att säkerställa maximal protein fånga. För parti bindande (blanda harts med proteinet lösningen) ett behov av att tillåta ~ 10 minuter inkubation vid rumstemperatur och längre (upp till 1 timme) vid 277 ° K. Baserat på affinitet styrka, kunde kåda tvätta göras under olika imidazol koncentrationer.
Sammantaget bör förändringen av varje steg i detta protokoll ske för att rena effektivt unikt protein målet att ta under övervägande denna rening system som guide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner Dr Amir Aharoni för hans stöd och Geula Davidov, Noam Grimberg och Chen Guttman för deras råd och kommentarer.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| French Press | Equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius AG | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher Scientific | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
- Faivre, D., Schuler, D.
- D'Andrea, L. D., Regan, L.
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).
- Brocard, C., Hartig, A. Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide? Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).
- Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b. Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).
- Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function. Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).
- Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria. J Mol Model. 15, 971-982 (2009).
- Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).
- Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host. J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).
- Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion. Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).
- Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).
- Okuda, Y., Fukumori, Y. Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli. FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).
- Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum. J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
