Summary
Die Zelle durchlässig Vernetzer DSP [Dithiobis-(Succinimidylpropionat)] stabilisiert vorübergehend und labile Wechselwirkung
Abstract
Die Dynamik der zellulären Maschinerie häufig auf vorübergehende und / oder schwache Protein-Assoziationen gebaut. Diese geringe Affinität Wechselwirkungen ausschließen strengen Methoden zur Isolierung und Identifizierung von Protein-Netzwerken um ein Protein von Interesse. Der Einsatz von chemischen Vernetzer erlaubt die selektive Stabilisierung der labilen Interaktionen, also unter Umgehung biochemischen Einschränkungen für die Reinigung. Hier präsentieren wir ein Protokoll zugänglich für Zellen in Kultur, dass ein homo Vernetzer verwendet mit einem Spacer-Arm von 12 Å, Dithiobis-(Succinimidyl proprionate) (DSP). DSP wird durch Reduktion einer Disulfidbrücke im Molekül gespalten. Die Vernetzung mit Immunaffinitätschromatographie der Proteine von Interesse mit magnetischen Beads kombiniert ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen, die sonst nicht überstehen würden Reinigung. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western-Blot-Techniken, und es kann bis zur Proteinidentifizierung skaliert werden durch Massenspektrometrie 1.
Stephanie A. Zlatic und Pearl V. Ryder trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Protocol
1. Vorbereitungen für die Vernetzung
- Sie werden auf Platte müssen eine ausreichende Anzahl von Zellen zur Isolierung von 500 ug Protein pro Standard-Rohr-Reaktion zu ermöglichen. Eine einzelne Röhre ausreichend sein kann für die Identifizierung von putativen Interaktionspartner eines Proteins von Interesse durch Immunoblot. In diesem Fall Bead gebunden Material kann mit SDS-PAGE-Probenpuffer (Immunpräzipitation) eluiert werden. Für massenspektrometrischen Analyse sollte die Zahl der normalen Reaktionen mindestens zehn Mal erhöht werden und Protein-Komplexe sollten durch out-Wettbewerb mit einem Peptidantigen durch den Antikörper verwendet (Immunaffinitätschromatographie) anerkannt eluiert werden. Diese Strategie ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen frei von Immunglobulin.
- Die optimale Zelldichte für die Vernetzung zwischen 75% und 90% Konfluenz. In hoher Konfluenz Bedingungen neigen Zellen, die auf jeder anderen Stapel, der nimmt die Zugänglichkeit der zellpermeablen Vernetzer, um alle Zellen.
- Zelltyp und experimentellen Bedingungen sollte auf dem Boden der Zelle Platte markiert werden. Wir routinemäßig auch Kontrollen mit Vehikel.
- Bereiten Sie alle Lösungen außer der DSP-Lösung vor der Vernetzung.
- Bereiten Sie einen Vorrat an Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit CaCl 2 0,1 mM und CaCl 2 1 mM (PBS / Ca / Mg) vor Beginn des Experiments. Die Zugabe von Kalzium-und Magnesium-Ionen ist entscheidend für die Adhäsion von Zellen an der Kultur Platte im Verlauf des Experiments. Lagerung bei 4 ° C.
- 50X Komplette Protease Inhibitor Cocktail - 1 Tablette in 1 ml Milli-Q Wasser gelöst. Lagerung bei -20 ° C.
- 20% Triton X-100 wiegt 10g Triton X -100 und verdünnt in einem Gesamtvolumen von 50 ml Milli-Q Wasser. Rock bei 4 ° C über Nacht und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Nicht länger als 1 Monat. Verwenden Verdünnungen von diesen 20% Aktien an die Lyse-und IP-Puffer unten beschrieben vorbereiten.
- 50X DSP Quenching-Lösung 1M TRIS auf pH 7,4. Lagerung bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine 10-fach Puffer A-Lösung.
10X Puffer A:- 50 mL 1 M HEPES
- 150 mL 5 M NaCl
- 10 mL 0,5 M EGTA
- 250 ul 2 M MgCl 2
- Der pH-Wert auf 7,4
- Bringen Endvolumen von 500 mL
1x Puffer A ist auch in Lysat und Immuno-magnetische-Fällung Puffer verwendet.
Buffer A 1X- 10 mM Hepes
- 150 mM NaCl
- 1 mM EGTA
- 0,1 mM MgCl 2
- pH-Wert 7,4
- Lysis Buffer 1X Puffer A + 0,5% Triton X-100.
- Immuno-magnetische Niederschlag Buffer (IP Buffer) 1X Puffer A + 0,1% Triton X-100.
2. Vorbereitung der Vernetzungslösung
- Bereiten Sie die DSP-Lösung unmittelbar vor der Anwendung auf Zellen. DSP ist stark hydrophob und sollte in DMSO vor der Verdünnung in PBS / Ca / Mg-Puffer gelöst werden. Lösen Sie 40 mg des DSP in 1 ml DMSO. Dies macht eine 100 mM Lösung von DSP (Das Molekulargewicht der DSP ist 404,42 g / mol).
- Warm einem geeigneten Volumen PBS / Ca / Mg bis 37 ° C, um eine Verwässerung der DSP / DMSO in PBS zu erleichtern.
Volumes für verschiedene Plattengrößen benötigt:
6-Well-Platte 2 mL pro Well
10 cm Platte 10 mL pro Platte
15 cm Platte 20 mL pro Platte - Add 10 &mgr; l von DSP / DMSO-Stammlösung pro 1 ml warmes PBS / Ca / Mg. Add DSP / DMSO Stammlösung tropfenweise mit wiederholten Mischen, bis alle DSP gelöst hat. Machen Sie eine Control-Lösung von 10 ul DMSO hinzugefügt, um alle 1 ml PBS / Ca / Mg.
- Legen Sie alle PBS / Ca / Mg-Lösungen in einem Eis-Wasser-Bad nicht länger als 10 min.
3. Bereiten Cells für Vernetzung
- Bereiten Sie ein Eiswasserbad, dass alle Platten der Vernetzung oder der Fahrzeugsteuerung Inkubation passen.
- Nehmen Platten aus dem 37 ° C Inkubator und legen Sie sie sofort in das Eis-Wasser-Bad.
- Wash-Zellen zweimal mit eiskaltem PBS / Ca / Mg. Verwenden Sie das gleiche Volumen, die Sie für den Vernetzer Inkubation verwenden (siehe Abschnitt 2.2).
- Entfernen zweiten Wäsche und fügen entweder Fahrzeugsteuerung oder DSP Vernetzung Pufferlösung.
- Inkubieren auf Eis für zwei Stunden. Sie sollten die Platten etwa alle 20 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Zellen, die durch Lösung bedeckt sind. Sie können vielleicht ein wenig DSP aus der Lösung ausfallen. Das ist normal.
4. Die Inaktivierung von DSP Reaction
- Bereiten Sie eine 1X DSP Abschrecken Lösung von 20 mM Tris pH 7,4 in PBS / Ca / Mg (20 ul 1 M Tris pH 7,4 je 1 ml PBS / Ca / Mg).
- Entfernen Sie das Fahrzeug-Steuerung und Vernetzung Lösungen.
- Add eiskalten Inaktivierung Lösung, Inkubation auf Eis für 15 Minuten.
5. Cell Lysis
- Während DSP Abschrecken Inkubation, bereiten Sie die Zell-Lyse-Puffer von 0,5% Triton X-100 in Puffer A mit Complete Protease Inhibitor Cocktail. Add 20 uL 50x Stammlösung von Komplett für alle 1 mL Lysepuffer.
- Nach der 15 Minuten DSP Abschrecken Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS / Ca / Mg.
- Add Lysepuffer + Komplett an Zellen und Fels bei 4 ° C für 30 Minuten. Einige schlugen vor, Volumen Lysepuffer für verschiedene Plattengrößen:
- 6-well-Platte 0,5 ml pro Vertiefung
- 10 cm Platte 1 mL pro Platte
- 15 cm Platte 1 mL pro Platte
- Nach der Lyse mit einem Zellschaber in die Zellen von der Platte zu sammeln. Achten Sie darauf, Lysate auf Eis zu halten, um Protease-Aktivität zu minimieren
- Spin Zelllysate für 15 Minuten bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge Mini-Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit (15.000 xg).
- Pipette der Überstand in ein frisches Röhrchen. Verwerfen des Pellets.
- Analysieren Protein-Ebene und fahren Sie mit Immunpräzipitation.
6. Vorbereitung Immuno-magnetische Beads Niederschlag
Hinweis: Dieser Schritt ist in der Regel direkt nach Beginn der 2 Stunden Vernetzung Inkubation gestartet.
- Kombinieren Sie 30 ul Dynal immunomagnetische Kügelchen, 500 ul von IP Buffer (1x Puffer A + 0,1% Triton X-100) und der entsprechenden Menge an Antigen-spezifischen Antikörpern zu Mikrozentrifugenröhrchen Schraubverschluss. Bereiten Antikörper-freie und nicht-spezifischer Antikörper Rohre für negative Kontrollen. Die entsprechende Menge an Antikörper sollte basierend auf einzelne Antigene während separaten Experimenten bestimmt werden. Kennzeichnen Sie alle IP Röhren.
- Lassen Sie die IP-Röhrchen in einem End-over-end Wippe bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubieren. Alternativ inkubieren Sie die IP-Rohre mit dem Antikörper über Nacht bei 4 ° Tag vor der Vernetzung.
- Nach der Inkubation tun, eine schnelle 10 Sekunden Mini-Zentrifugation, um die Perlen am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln.
- Schieben Sie die Rohre in die magnetische Halterung, die die magnetischen Kügelchen ziehen wird vom Boden des Röhrchens. Mit den Perlen sicher aus der Art und Weise, können Sie nun ganz einfach wegwaschen alle ungebundenen Antikörper.
- Verwenden Sie eine kleine Bohrung Aspirator Spitze wie eine Spitze für Gel oder p200 Spitze der Inkubationspuffer und alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Sobald die Inkubationsvolumen entfernt in 1 ml IP-Puffer hinzu.
- Cap das Rohr vorsichtig resuspendieren die Perlen, und inkubieren alle IP-Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit end-over-end Rotation.
- Wiederholen Sie den 5 Minuten Waschschritt (Schritte 6.3 bis 6.6) noch einmal mit einem frischen Milliliter IP Buffer.
- Die IP-Röhren können in der letzten Waschung Inkubation bleiben, bis das vernetzte Lysat ist bereit, um die Perlen hinzugefügt werden.
7. Inkubieren Vernetzte Lysate mit Immuno-magnetische Beads
- Nach der letzten Waschung Spin Immuno-magnetische Kügelchen, die in einem Mini-Zentrifuge für 10 Sekunden. Dann fahren Sie mit den Rohren in die magnetische Halterung rutschen.
- Auch mit einem kleinen Bohrung Absaugspitze, entfernen Sie die Inkubationszeit Volumen aus der Tube. Sofort im 500 mL aus vernetztem Zelllysat (vorausgesetzt Lysat bei 1 pg / mL), um die Röhrchen mit immuno-magnetischen Kügelchen. Wenn Sie verwenden möchten Peptid Wettbewerb als negative Kontrolle, sollte eine entsprechende Menge an Peptid an dieser Stelle aufgenommen werden. Frühere Experimente durchgeführt werden, um entsprechende Peptid Wettbewerbsbedingungen zu bestimmen. Alternativ können Sie Lysat freien Immuno-magnetische Kügelchen als negative Kontrolle haben. In diesem Fall sofort hinzufügen 500 ul der Lysate Buffer (1x Puffer A + 0,5% Triton X-100) + Komplette dem Immuno-magnetische Kügelchen.
- Vorsichtig resuspendieren Perlen. Resuspendierten Beads bei 4 ° in einer End-over-end Rotation für 2 Stunden inkubiert werden.
8. Wash Unbound Lysate aus Perlen
- Sobald Lysat über ausreichende Inkubationszeit hatte, nicht einen schnellen 10 Sekunden Spin in ein Mini-Zentrifuge. Dann schieben Sie die Rohre in die Magnethalterung. Die magnetische Halterung sollte in einem Eisbad für den Rest des Experiments gehalten werden.
- Mit einem kleinen Bohrung Aspirator Spitze, entfernen Sie alle ungebundenen Lysat. Unmittelbar nachdem alle ungebundenen Lysat entfernt 1 mL IP-Puffer.
- Cap der Röhre und sanft resuspendieren Perlen.
- Sobald die Kügelchen sind resuspendiert wiederholen Sie die Perle Pelletierung Schritt (8,1).
- Wieder absaugen alle Inkubationsvolumen und sofort 1 ml IP-Puffer, dann verschließen Sie die Tube.
- Vorsichtig resuspendieren die Perlen in IP Buffer. Inkubieren resuspendierten Beads für 5 Minuten bei 4 ° mit end-over-end zu schaukeln.
- Wiederholen Sie die Perle Waschschritte (8,4 bis 8.6) 4 weitere Male.
9. Denaturieren Probe und Sammeln von Perlen
- Nach all der Immuno-magnetische Niederschlag Rohren gewaschen wurden, re-Sediment der Perlen (8,1), und schieben Sie Rohre in denMagnethalter.
- Gebundene Proteine, die immuno-magnetische Kügelchen sind in denaturierenden Bedingungen entfernt. Absaugen der letzten IP Buffer waschen und entfernen Sie die IP-Rohr aus dem Magnethalter.
- Add 1x Gel Sample Buffer, um die IP Rohr oberhalb des Wulstes Pellet zu bündeln die Perlen am unteren Rand der Röhre wieder. Die Höhe der Probenpuffer hängt auch Größe des Gels verwendet werden. Möglicherweise müssen Sie leicht auf den Boden der Röhre, um alle der Perlen in der Gel-Probenpuffer resuspendiert bekommen.
- Wiederholen Sie die Denaturierung (9,2 bis 9,3) für jede IP-Rohr.
- Immuno-magnetische Kügelchen in Gel-Probenpuffer resuspendiert werden dann bei 75 ° C für 5 Minuten, um die Denaturierung abzuschließen.
- Sobald die Probe wurde denaturiert es auf einer SDS-PAGE-Gel kann für Western-Blot durchgeführt werden. Entleerte Immuno-Magnetic Beads kann erneut durch Zentrifugation pelletiert und aus der Probe mit dem Magnethalter.
10. Elution von vernetztem Komplexe mit antigenen Peptiden (Immunaffinitätschromatographie).
- Nach all der Immuno-magnetische Immunpräzipitation Rohre wurden gewaschen, re-Sediment der Perlen (8,1), und schieben Sie Rohre in den Magnethalter. Saugen Sie den Überstand und mit 10 ul Puffer A ergänzt mit dem antigenen Peptid, das durch den Antikörper für Immunisolation von Protein-Komplexen eingesetzt anerkannt. Sie sollten testen Konzentrationen im Bereich von 10 bis 200 pM für die effiziente Elution.
- Inkubieren Sie die Perlen für 2 h bei 4 ° C.
- Legen Sie Perlen in der magnetischen stehen und sorgfältig wieder die 10 ml eluierte Material. Speichern Sie diese Überstand.
- Schnell Waschen der Kügelchen mit Puffer A und entsorgen Sie die Wäsche. Speichern Sie die Perlen.
- Add Gel Sample Buffer, um die gespeicherten Überstand und Perlen zu einer Konzentration von 1X. Inkubieren diese Rohre bei 75 ° C für 5 Minuten.
- Analysieren Perlen-und Peptid-Eluat durch SDS-PAGE. Das Eluat sollte frei von IgG sowohl durch Protein-Färbung von SDS-PAGE oder Immunoblots (Abbildung 1B). Dieses Material frei von IgG ist für Massenspektrometrie.
Abbildung 1. Isolierung von AP-3 interagierende Protein-Komplexen und Membranproteine. HEK293-Zellen (A) oder PC12-Zellen (B) wurden entweder in Gegenwart Kontrolle über das Fahrzeug behandelt (DMSO, ungerade Gassen Abb. 1A) oder DSP (auch Bahnen Abb.. 1A oder alle Bahnen in Abb. 1B). Abb.; geklärt Extrakte wurden entweder mit Perlen allein (Abb. 1A, Lanes 3-4), Transferrin-Rezeptor-Antikörper (Abb. 1A, Lanes 5-6) oder AP-3 δ Antikörper (Abb. 1A, Lanes 7-10 inkubiert . 1B, Bahnen 1-10). Immunkomplexe mit SDS-PAGE-Probenpuffer (Abb. 1A) wurden eluiert, Buffer A allein oder (Abb. 1B, Bahnen 1-2), oder Puffer A mit steigenden Konzentrationen des δ antigene Peptid entsprechend den Aminosäuren 680 710 ergänzt der menschlichen δ-Adaptin (NCBI: AAD03777; gi: 1923266) (Abb. 1B, Bahnen 3-10). Dieses Peptid bindet die δ-Antikörper. Nach Peptid Elution wurden die Überstände (S) und Perlen (B) durch Immunoblot (Abb. 1B) analysiert. AP-3, die mit Antikörpern gegen die δ, β3 und σ3 Untereinheiten erkannt wird, Copräzipitate mit den folgenden lösliche Faktoren: Clathrin schwere Kette (CHC), die BLOC-1-Untereinheit pallidin und der HOPS-Komplex Untereinheit vps33b, sowie die Membranproteine Phosphatidylinositol-4-Kinase-Typ-II-alpha (PI4KIIα) und der Zink-Transporter 3 (ZnT3). Beachten Sie das Fehlen von IgG-Maus schweren Ketten in das Peptid eluiert Überstand in Abb.. 1B.
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Discussion
DSP, eine Membran durchlässig, chemisch reduzierbaren Vernetzer mit einem Spacer-Arm von 12 Å wird verwendet, um transiente Protein-Interaktionen 1,2,3,4 stabilisieren. Hier haben wir diese Strategie mit dem Adapter-Komplex AP-3 ein lösliches Protein-Komplex, und erkennt möglichen Membranproteine in Vesikeln aus Endosomen 5 veranschaulicht. AP-3 bindet selektiv an die Zink-Transporter ZnT3 und der Lipid-Kinase-Phosphatidylinositol-4-Kinase-Typ-II-alpha, aber nicht Transferrin-Rezeptor 1,4,6. Wir erweiterten diese Beobachtungen auf die Identifizierung eines AP-3-Protein-Interaktion Netzwerk von Membranproteinen und cytosolische Faktoren durch Massenspektrometrie 1. Niedriger Hintergrund Immuno-magnetische Niederschlag folgt Vernetzung zu interagierende Proteine zu identifizieren. Darüber hinaus ist ein Katalog erschienen von Proteinen, die nicht-selektiv an magnetische Kügelchen binden können für einen ersten Durchgang Beseitigung von nicht-spezifische Protein-Isolierung und Identifizierung durch Massenspektrometrie 7. DSP nutzt aminreaktiven Estergruppen zu primären Aminen wie Lysine oder die Aminosäure-Terminus von Proteinen zu verknüpfen. Nach denaturierenden Bedingungen, ist die DSP-Molekül in zwei Hälften gespalten, so dass kurze chemischen Gruppen auf der verknüpften Aminosäuren. Für einige Antigene gibt es einen Rückgang in Immunreaktivität Signale durch Immunoblot beim Vergleich gleich Protein Lasten zwischen DMSO-Steuerung und DSP behandelten Zellen (Abbildung 1a). Es ist möglich, dass dieser Rückgang resultiert aus verringerten Antikörper-Affinität an der DSP Lysine modifiziert. Abgesehen von diesen seltenen Fällen, verbessert die Verwendung von DSP chemische Vernetzung die Möglichkeit, enger Wechselwirkung Membran-assoziierte Proteine zu erkennen.
Proteine oder Komplexe peripher mit der cytosolischen Seite der Membran verbunden sind, wie AP-3 sind an Membranen bei normaler Inkubationstemperatur von 37 ° C lokalisiert Doch bei Raumtemperaturen von 15-20 ° C die AP-3 Komplex langsam verteilt, um das Cytosol. So, um Wechselwirkungen zwischen AP-3 und Membran-assoziierte Proteine zu erfassen, muss die Innentemperatur dieser Zellen schnell auf 4 ° C abgekühlt werden Der beste Weg, dies zu erreichen, ist 1) haben alle Puffer Inkubation im Eisbad vor Entfernung von Zellen aus dem 37 ° C Inkubator, 2) sofort zu entfernen Sie alle Medien aus dem warmen Platte von Zellen und ersetzen mit eiskaltem Puffer und 3) Um die Zellen auf einem Eisbad für die Gesamtheit der Vernetzung Experiment ausgesetzt.
DSP ist nicht löslich in Wasser und es kommt zur Erwärmung des PBS / Ca / Mg-Lösung auf 37 ° C vor der Zugabe von DSP / DMSO-Lösung ist empfehlenswert. Da jedoch die Zellen auf eine Temperatur von 4 ° C zu halten, sollten die entsprechenden DSP Vernetzungslösung in ein Eisbad gestellt werden, sobald die DSP vollständig gelöst ist. Wenn der DSP nicht vollständig gelöst große Mengen an Niederschlag bilden, wie die Lösung kühlt (eine kleine Menge des Niederschlags ist normal). Wenn eine große Menge an Niederschlag auftritt, versuchen Erhitzen der Lösung wieder auf 37 ° C für eine vollständige Solubilisierung und Rückkühlung. Wenn die DSP wieder fällt aus der Lösung, müssen Sie an die frische Vernetzung Lösung herzustellen. Die schnelle Beseitigung von DSP aus der Lösung aufgrund unvollständiger Solubilisierung sollte nicht mit dem langsamen Bildung einer kristallinen Schicht, die in die Vertiefungen der DSP behandelten Zellen erscheint verwechselt werden. Das Vorhandensein dieses DSP kristallinen Schicht nicht mit der Vernetzungsreaktion in Zellen einzugreifen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, um VF (NS42599 und GM077569) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
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