Summary
De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele interacties
Abstract
Het dynamische karakter van mobiele machines wordt vaak gebouwd op voorbijgaande aard en / of zwak eiwit verenigingen. Deze lage affiniteit interacties weg strenge methoden voor de isolatie en identificatie van eiwitten netwerken rond een eiwit van belang. Het gebruik van chemische crosslinkers kan de selectieve stabilisatie van labiele interacties, waardoor het omzeilen van biochemische beperkingen voor zuivering. Hier presenteren wij een protocol vatbaar voor cellen in cultuur die een homobifunctionele crosslinker gebruikt met een spacer arm van 12 Å, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is gesplitst door reductie van een disulfide binding in het molecuul. Cross-linking, gecombineerd met immunoaffiniteitschromatografie van eiwitten van belang met magnetische kralen maakt de isolatie van eiwitcomplexen die anders niet zou weerstaan zuivering. Dit protocol is compatibel met de reguliere western blot technieken en kan worden opgeschaald voor eiwit-identificatie door middel van massaspectrometrie 1.
Stephanie A. Zlatic en Pearl V. Ryder droegen ook voor dit werk.
Protocol
1. Voorbereiding voor Crosslinking
- U moet plaat een voldoende aantal cellen tot isolatie van 500 ug eiwit per standaard buis reactie mogelijk te maken. Een enkele buis kan genoeg zijn voor de identificatie van vermeende interactoren van een eiwit van interesse door de immunoblot. In dit geval kraal gebonden materiaal kan worden geëlueerd met SDS-PAGE sample buffer (immunoprecipitatie). Voor massaspectrometrie-analyse, moet het aantal standaard-reacties worden verhoogd tot minstens tien keer en eiwitcomplexen worden geëlueerd door out-competitie met een peptide-antigeen herkend door het antilichaam dat wordt gebruikt (immunoaffiniteitschromatografie). Deze strategie zal de isolatie van eiwitcomplexen vrij van immunoglobuline.
- De optimale celdichtheid voor de verknoping tussen 75% en 90% confluentie. In hoge confluentie omstandigheden, cellen hebben de neiging om stapel op elkaar, dat vermindert de toegankelijkheid van de cel-permeabele crosslinker naar alle cellen.
- Celtype en de experimentele conditie moet worden op de bodem van de cel plaat. We zijn regelmatig controles met het voertuig alleen.
- Bereid alle oplossingen BEHALVE de DSP-oplossing voorafgaand aan de verknoping.
- Bereid een voorraad van fosfaat-gebufferde zoutoplossing buffer met CaCl2 0,1 mm en CaCl 2 1 mM (PBS / Ca / Mg) vóór het begin van het experiment. De toevoeging van calcium en magnesium-ionen is van cruciaal belang voor de hechting van cellen in de petrischaal in de loop van het experiment. Bewaren bij 4 ° C.
- 50X Compleet proteaseremmer Cocktail - 1 tablet opgelost in 1 ml Milli-Q water. Bewaren bij -20 ° C.
- 20% Triton X-100 Weeg 10 g Triton X -100 en verdund in totaal volume van 50 ml Milli-Q water. Rots bij 4 ° C gedurende de nacht en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Niet opslaan voor meer dan 1 maand. Gebruik verdunningen van deze 20% aandelen van de afbraak en het IP-buffers hieronder beschreven te bereiden.
- 50X DSP Afschrikken Solution 1M TRIS tot pH 7,4. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid een 10x Buffer Een oplossing.
10X Buffer A:- 50 ml 1 M HEPES
- 150 ml 5 M NaCl
- 10 ml 0,5 M EGTA
- 250 ui 2 M MgCl 2
- Pas de pH tot 7,4
- Breng uiteindelijk volume van 500 ml
1x Buffer A wordt ook gebruikt in lysaat en immuno-magnetische-precipitatie buffers.
Buffer A 1X- 10 mM Hepes
- 150 mM NaCl
- 1 mM EGTA
- 0.1 mM MgCl 2
- pH 7,4
- Lysis Buffer 1X buffer A + 0,5% Triton X-100.
- Immuno-Magnetic Neerslag Buffer (IP Buffer) 1X buffer A + 0,1% Triton X-100.
2. Voorbereiding van de verknoping Solution
- Bereid de DSP-oplossing onmiddellijk voor het aanbrengen aan cellen. DSP is zeer hydrofoob en moet worden opgelost in DMSO voordat verdund in PBS / Ca / Mg buffer. Los 40 mg van de DSP in 1 ml DMSO. Dit maakt een 100 mM oplossing van DSP (Het molecuulgewicht van DSP is 404,42 g / mol).
- Warm een geschikt volume van PBS / Ca / Mg tot 37 ° C om de verwatering van de DSP / DMSO gemakkelijker in PBS.
De volumes die nodig is voor diverse plaat maten:
6-wells plaat 2 ml per well
10 cm plaat 10 ml per plaat
15 cm plaat 20 ml per plaat - Voeg 10μL van de DSP / DMSO voorraad oplossing voor elk 1 ml warm PBS / Ca / Mg. Voeg DSP / DMSO voorraadoplossing druppelsgewijs met herhaalde mengen totdat al het DSP is opgelost. Maak een controle-oplossing van 10 pl DMSO toegevoegd aan elke 1 ml PBS / Ca / Mg.
- Plaats alle PBS / Ca / Mg-oplossingen in een ijs-waterbad niet langer dan 10 minuten.
3. Cellen voor te bereiden Crosslinking
- Bereid een ijs-waterbad die past op alle platen voor verknoping of controle over het voertuig incubatie.
- Neem platen uit de 37 ° C incubator en onmiddellijk plaats ze in het ijs-waterbad.
- Was de cellen twee keer met ijskoude PBS / Ca / Mg. Gebruik dezelfde volume dat u wilt gebruiken voor de crosslinker incubatie (zie paragraaf 2.2).
- Verwijder seconden wassen en toe te voegen of controle over het voertuig of DSP verknoping bufferoplossing.
- Incubeer op ijs gedurende twee uur. U dient de platen ongeveer elke twintig minuten om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn gedekt door oplossing. U ziet mogelijk een kleine hoeveelheid van DSP neerslag uit de oplossing. Dit is normaal.
4. Inactivatie van DSP reactie
- Bereid een 1X DSP afschrikken oplossing van 20 mM Tris pH 7,4 in PBS / Ca / Mg (20 pi van 1 M Tris pH 7,4 voor elke 1 ml PBS / Ca / Mg).
- Verwijder de controle over het voertuig en de verknoping oplossingen.
- Voeg ijskoude inactivatie oplossing en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
5. Cell Lysis
- Tijdens de DSP quenching incubatie, de voorbereiding van de cel lysis buffer van 0,5% Triton X-100 in Buffer A met complete proteaseremmer cocktail. Voeg 20 ul 50X voorraad oplossing van Complete voor iedere 1 ml lysis buffer.
- Na de 15 minuten DSP quenching incubatie, wassen cellen twee keer met PBS / Ca / Mg.
- Voeg lysis buffer + Compleet aan cellen en rock bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Sommigen stelden voor volumes van lysis buffer voor diverse plaat maten:
- 6-wells plaat 0,5 ml per well
- 10 cm plaat 1 ml per plaat
- 15 cm plaat 1 ml per plaat
- Na lysis, gebruik dan een cel schraper om de cellen van de plaat te halen. Zorg ervoor dat lysaten te houden op het ijs om protease-activiteit te minimaliseren
- Spin cellysaten gedurende 15 minuten bij 4 ° C in een bench-top mini-centrifuge op topsnelheid (15.000 xg).
- Pipetteer het supernatant in een nieuwe buis. Gooi de pellet.
- Analyseren eiwitgehaltes en ga verder met immunoprecipitatie.
6. Voorbereiden Immuno-magnetische Neerslag Beads
Opmerking: Deze stap wordt meestal gestart direct na het begin van de 2 uur verknoping incubatie.
- Combineer 30 pi van Dynal immunomagnetische kralen, 500 ul van IP-buffer (1x Buffer A + 0,1% Triton X-100) en de juiste hoeveelheid van antigeen-specifiek antilichaam te microcentrifugebuizen screwtop. Bereid antilichaam-vrij en niet-specifieke antilichaam buizen voor negatieve controles. De juiste hoeveelheid antilichaam moet worden bepaald op basis van de individuele antigenen tijdens de diverse experimenten. Label alle IP-buizen.
- Laat de IP-buizen aan incuberen in een end-over-end rocker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. U kunt ook het IP-buizen 's nachts geïncubeerd met een antilichaam bij 4 ° de dagen voorafgaand aan de verknoping.
- Na de incubatie, doe een snelle 10 seconden mini-centrifugatie om de parels te verzamelen op de bodem van de buis.
- Schuif de buizen in de magnetische houder, die trekt de magnetische korrels uit de buurt van de bodem van de buis. Met de kralen veilig uit de weg, kunt u nu gemakkelijk weg te wassen elke niet-gebonden antilichaam.
- Gebruik een kleine boring aspirator tip, zoals een gel laad-tip, of P200 tip om de incubatiebuffer en alle niet-gebonden antilichaam te verwijderen. Zodra de incubatie volume wordt verwijderd toe te voegen in 1 ml van IP-Buffer.
- Dop van de buis, zacht resuspendeer de kralen, en incubeer alle IP-buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met een end-over-end rotatie.
- Herhaal de 5 minuten wasstap (stappen 6.3 tot 6.6) nog eens met een frisse milliliter van IP-Buffer.
- Het IP-buizen kunnen blijven in de laatste wasbeurt incubatie totdat de verknoopte lysaat is klaar om te worden toegevoegd aan de kralen.
7. Incubeer Vernet Lysate met Immuno-magnetische Beads
- Na de laatste wasbeurt draaien immuno-magnetische korrels, die in een mini-centrifuge voor 10 seconden. Ga dan naar de buizen glijden in de magnetische houder.
- Opnieuw, met behulp van een kleine boring aspiratie tip, verwijder de incubatie volume van de buis. Onmiddellijk toevoegen 500 pi van verknoopt cellysaat (in de veronderstelling lysaat bij 1 ug / ml) om de buisjes met immuno-magnetische korrels. Als u gaat gebruiken peptide concurrentie als een negatieve controle, dient een geschikte hoeveelheid peptide te nemen op dit punt. Eerdere experimenten moeten worden uitgevoerd om geschikte peptide concurrentie voorwaarden vast te stellen. Als alternatief kunt u lysaat gratis immuno-magnetische korrels als een negatieve controle te hebben. In dit geval, onmiddellijk voeg 500 ul van Lysate Buffer (1x Buffer A + 0,5% Triton X-100) + Compleet naar de immuno-magnetische korrels.
- Voorzichtig resuspendeer de kralen. Geresuspendeerd kralen moet worden geïncubeerd bij 4 ° in een end-over-end rotatie voor 2 uur.
8. Was geconsolideerd Lysate van Beads
- Zodra lysaat heeft voldoende incubatietijd, doe een snelle 10 seconden draaien in een mini-centrifuge. Dan de buizen dia in de magnetische houder. De magnetische houder moet worden bewaard in een ijsbad voor de rest van het experiment.
- Met behulp van een kleine boring afzuigkap tip, verwijder dan alle ongebonden lysaat. Onmiddellijk nadat alle ongebonden lysaat wordt verwijderd voeg 1 ml van IP-Buffer.
- Dop van de buis en voorzichtig resuspendeer de kralen.
- Zodra de kralen zijn geresuspendeerd herhaalt u de kraal pelleteren stap (8,1).
- Opnieuw aspireren korting op alle van de incubatie volume en voeg onmiddellijk 1 ml van IP-Buffer, dan is de dop op de tube.
- Voorzichtig resuspendeer de kralen in IP Buffer. Incubeer geresuspendeerd kralen gedurende 5 minuten bij 4 ° met end-over-end schommelen.
- Herhaal de kraal wasstappen (8,4 tot 8,6), vier keer.
9. Denatureren monster en verzamel van Beads
- Nadat al het immuno-magnetische neerslag buizen zijn gewassen, re-sediment van de kralen (8,1) en schuif buizen in demagnetische houder.
- Eiwitten gebonden aan de immuno-magnetische korrels worden verwijderd in denaturerende omstandigheden. Aspireren uit de laatste IP-Buffer wassen en verwijder het IP-buis van de magnetische houder.
- Voeg 1x Gel Sample Buffer naar het IP-buis net boven de hiel pellet te bundelen de parels op de bodem van de buis weer. De hoeveelheid van het monster buffer is afhankelijk van de goed grootte van de gel te gebruiken. Mogelijk moet u voorzichtig tik op de bodem van de buis om alle kralen geresuspendeerd in de Gel Sample Buffer te krijgen.
- Herhaal het denatureren proces (9.2 tot 9.3) voor elk IP-buis.
- Immuno-magnetische korrels gesuspendeerd in Gel Sample Buffer worden dan verwarmd bij 75 ° C gedurende 5 minuten om de denaturering proces te voltooien.
- Nadat het monster is gedenatureerd kan worden uitgevoerd op een SDS-PAGE gel voor western blotting. Geleegd Immuno-magnetische korrels kunnen opnieuw worden gepelleteerd door centrifugeren en verwijderd uit het monster met de magnetische houder.
10. Elutie van Vernet Complexen met antigene peptiden (immunoaffiniteitschromatografie).
- Nadat al het immuno-magnetische immunoprecipitatie buizen zijn gewassen, re-sediment van de kralen (8,1) en schuif buizen in de magnetische houder. Aspireren supernatant en voeg 10 ul van buffer A aangevuld met de antigene peptiden herkend door het antilichaam dat wordt gebruikt voor de immunoisolation van eiwitcomplexen. U moet testen concentraties variërend 10 tot 200 uM voor een efficiënte elutie.
- Incubeer de kralen gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Zet kralen in de magnetische staan en voorzichtig te herstellen van de 10 ml geëlueerd materiaal. Bewaar deze supernatant.
- Snel was de kralen met buffer A en gooi de was. Sla de kralen.
- Voeg Gel Sample Buffer naar de opgeslagen supernatant en kralen tot een concentratie van 1x. Incubeer deze buizen bij 75 ° C gedurende 5 minuten.
- Analyseren van kralen en peptide eluaat door SDS-PAGE. Het eluaat moet vrij zijn van IgG worden zowel door eiwitten smet van de SDS-PAGE of door immunoblots (Figuur 1B). Dit materiaal vrij is van IgG is geschikt voor massa-spectrometrie.
Figuur 1. Isolatie van AP-3 interagerende eiwitcomplexen en membraaneiwitten. HEK293 cellen (A) of PC12 cellen (B) werden behandeld in de aanwezigheid van controle over het voertuig (DMSO, oneven rijstroken fig. 1A) of DSP (zelfs rijstroken Fig. 1A of alle rijstroken in figuur 1B). Geklaarde extracten werden ofwel geïncubeerd met kralen alleen (Fig. 1A, Lanes 3-4), transferrine-receptor antilichamen (Fig. 1A, Lanes 5-6), of AP-3 δ antilichamen (Fig. 1A, Lanes 70-10; Fig . 1B, lanen 1-10). Immuuncomplexen werden geëlueerd met SDS-PAGE sample buffer (Fig. 1A), Buffer A alleen of (Fig. 1B, lanen 1-2), of Buffer A aangevuld met toenemende concentraties van het δ antigene peptide dat overeenkomt met de aminozuren 680 710 van de menselijke δ-adaptin (NCBI: AAD03777; gi: 1.923.266) (Fig. 1B, lanen 3-10). Dit peptide bindt de δ antilichaam. Na het peptide elutie werden supernatantia (S) en kralen (B) geanalyseerd met behulp van immunoblot (Fig. 1B). AP-3, die wordt gedetecteerd met antilichamen tegen de δ, β3, en σ3 subeenheden, coprecipitates met de volgende oplosbare factoren: clathrine zware keten (CHC), de BLOC-1 subunit pallidin, en de hop complex subeenheid vps33b, alsmede de membraaneiwitten fosfatidylinositol-4-kinase type II alpha (PI4KIIα) en de zink-transporter 3 (ZnT3). Let op de afwezigheid van IgG muis zware ketens in het peptide geëlueerd supernatant in Fig. 1B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DSP, een membraan-permeabel, chemisch reduceerbaar crosslinker met een spacer arm van 12 A wordt gebruikt om tijdelijke eiwit interacties 1,2,3,4 stabiliseren. Hier hebben we een voorbeeld van deze strategie met de adapter complex AP-3 een oplosbare proteïne complex dat herkent en sorteert membraaneiwitten in blaasjes uit endosomen 5. AP-3 bindt selectief aan de zink-transporter ZnT3 en de lipide kinase fosfatidylinositol-4-kinase type II alpha, maar niet transferrine-receptor 1,4,6. We hebben deze observaties uitgebreid tot de identificatie van een AP-3 eiwit interactie netwerk van membraaneiwitten en cytosolische factoren door middel van massaspectrometrie 1. Een lage achtergrond immuno-magnetische neerslag volgt verknoping te interagerende eiwitten te identificeren. Bovendien is een gepubliceerde catalogus van eiwitten die zich binden niet-selectief aan magnetische korrels zorgt voor een first-pass eliminatie van niet-specifieke eiwit isolatie en identificatie door middel van massaspectrometrie 7. DSP maakt gebruik van amine-reactieve ester groepen te bezoeken primaire amines zoals lysines of de aminozuur-uiteinde van eiwitten. Bij denaturerende omstandigheden, is de DSP molecule gesplitst in half, waardoor er korte chemische groepen op de gekoppelde aminozuren. Voor sommige antigenen is er een daling in immunoreactiviteit signalen door middel van immunoblot bij het vergelijken van gelijke ladingen eiwit tussen de DMSO controle en DSP behandelde cellen (Figure1A). Het is mogelijk dat deze daling het gevolg is van verminderde antilichaam affiniteit voor de DSP lysines gewijzigd. Afgezien van deze zeldzame gevallen is het gebruik van DSP chemische verknoping vergroot het vermogen om nauw samen te interageren membraan-geassocieerde eiwitten te detecteren.
Eiwitten of proteïnen complexen perifeer worden geassocieerd met het cytosolische folder van membranen, zoals de AP-3 zijn gelokaliseerd aan membranen bij normale incubatie temperatuur van 37 ° C. Echter, op kamer temperatuur van 15-20 ° C de AP-3 complex langzaam herverdeelt naar de cytosol. Dus, om de interacties tussen de AP-3 en membraan-geassocieerde eiwitten te vangen, moet de interne temperatuur van deze cellen snel worden afgekoeld tot 4 ° C. De beste manier om dit te bereiken is om 1) alle buffers incuberen in een ijsbad voorafgaand aan het verwijderen van cellen uit de 37 ° C incubator, 2) om onmiddellijk alle warme materiaal uit de plaat van cellen en met een ijskoude buffer vervangen, en 3) om de cellen te opgehangen aan een ijsbad voor het geheel van de verknoping experiment te houden.
DSP is niet oplosbaar in water en dus de opwarming van de PBS / Ca / Mg-oplossing tot 37 ° C voor toevoeging van DSP / DMSO-oplossing is aan te raden. Maar omdat de cellen nodig hebben om een temperatuur van 4 ° C te houden, moet de DSP verknoping oplossing worden geplaatst in een ijsbad na het DSP is volledig opgelost. Als de DSP is niet volledig opgelost grote hoeveelheden neerslag zullen vormen als de oplossing koelt (een kleine hoeveelheid neerslag is normaal). Als een grote hoeveelheid neerslag optreedt, probeer dan het verwarmen van de oplossing opnieuw op 37 ° C voor een volledige solubilisatie en Recool. Als de DSP herhaaldelijk valt uit de oplossing, moet u mogelijk om verse verknoping oplossing te bereiden. De snelle verwijdering van DSP uit de oplossing door onvolledige solubilisatie moet niet worden verward met de trage vorming van een kristallijne laag dat verschijnt in de putjes van de DSP-behandelde cellen. De aanwezigheid van deze DSP-kristallijne laag interfereert niet met de cross-linking reactie in de cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health voor VF (NS42599 en GM077569).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
