Summary
هذا يصف جزئية جراحة ربط الشريان السباتي ، الذي يسبب تدفق الظروف المضطربة والتنمية اللاحقة تصلب الشرايين (في غضون أسبوعين) مع الأوعية الدموية الجديدة intraplaque (في أربعة أسابيع) في الشريان السباتي الماوس المشتركة. نحن أيضا وصف أسلوب الرواية من العزلة RNA من البطانية السباتي ، وتوفير RNA عالية النقاء البطانية.
Abstract
على الرغم من ارتباط وثيق معروفة ، وقد أدلة مباشرة تربط تدفق بالانزعاج لتصلب الشرايين مفتقدة. استخدمناها مؤخرا نسخة معدلة من أساليب الربط الجزئي السباتي [1،2] لإظهار أنه يحرض بشدة ظروف تدفق منخفض ومتذبذبة ، واثنين من الخصائص الرئيسية لتدفق مضطربا ، في الشريان السباتي الماوس المشتركة. باستخدام هذا النموذج ، وقدمنا الأدلة المباشرة التي تتدفق بالانزعاج بل يؤدي إلى تصلب الشرايين التنمية السريعة والقوية في الماوس ئي خروج المغلوب E [3]. نحن أيضا بتطوير طريقة التحضير RNA البطانية مع نقاء عالية من البطانية السباتي الماوس [3]. استخدام هذا النموذج من الفئران ، والأسلوب ، وجدنا أن ربط أسباب الخلل الجزئي البطانية في الأسبوع ، تلاه تشكيل عصيدة قوية وسريعة في غضون اسبوعين في hyperlipidemic نموذج الفأر مع ملامح تشكيل الآفة المعقدة مثل اتساع الأوعية الدموية intraplaque قبل أربعة أسابيع. هذا السريع
Protocol
1. الجزئي من ربط الشريان السباتي الأيسر
- وتستخدم الفئران في 8 أسابيع من العمر ~. يوصى وزن الفئران على الأقل 18 غراما.
- تعقيم الأدوات لمدة 30 ثانية في حبة تعقيم الأدوات والسماح لتبرد
- تحريض التخدير مع الكيتامين (80mg/kg) وزيلازين (10mg/kg) داخل الصفاق (IP) حقن تخدير أو البديلة التي وافقت عليها IACUC. الملكية الفكرية للحقن ، حقن فأر في الربع المنخفض الأيسر من البطن.
- الماوس مكان في الغرفة حتى الاحترار تخدير كامل. تحقق من عمق التخدير مع الاستجابة لقرصة أخمص قدميه.
- مكان الماوس على مسرح العمليات الجراحية ، مستلق في (بطن تصل الجانب) الموقف. الشريط الكفوف الصدارة حتى النخيل وحيد الخلفيتين ، الكفوف وصولا الى المرحلة.
- تطبيق الليبرالية مبلغ من عامل مزيل الشعر (نير مثلا) إلى الرقبة والفك السفلي بين القص و. التدليك بلطف حتى يتم إزالة كل الشعر.
- تنظيف قبالة عامل مزيل الشعر وتطبيق الليبرالية مبلغ من Betadine إلى منطقة نزعه.
- إعداد 1 بوصة طويلة أقسام خياطة الحرير 6-0 لعملية ربط. وسوف تحتاج كل الماوس قطعتين من الخيط.
- باستخدام مقص حاد صغير ، وجعل شق عمودي 4 - 6mm في منتصف الرقبة. كلا من الجلد واللفافة الكامنة وراء الحاجة إلى أن تقطع.
- نقل الغدة النكفية اليسرى من خط الوسط الى اليسار وبدء تشريح بصراحة مجرد حق من القصبة الهوائية. يجب أن تكون قادرا على تحديد النبض السباتي الأيسر مشتركة بسهولة.
- اتبع السباتي المشترك caudally حتى يمكنك تحديد موقع والتشعب.
- تشريح بصراحة والتشعب لفضح ما يلي أربعة فروع القاصي قبالة الشريان السباتي الأيسر مشتركة : الخارجية الشريان السباتي ، الشريان السباتي الداخلي ، الشريان القذالي ومتفوقة شريان الغدة الدرقية. يمكن لهذه السفن ، والغدة الدرقية وخصوصا متفوقة ، تكون هشة. كن حذرا جدا مع تشريح الخاص بك.
- التعادل قبالة السباتي الخارجي ABOVE متفوقة الغدة الدرقية باستخدام 6-0 خياطة الحرير. للقيام بذلك ، ملقط مرور واحد تحت الشريان والاستيلاء على قطعة من الخيط قبل القطع بمساعدة ملقط الأخرى الخاصة بك. سحب بلطف لتمرير الخيط تحت الشريان. تجنب التعادل بشدة أي نوع من الأنسجة المحيطة الوقوع في عقدة. إذا كنت التعادل دون تقلع من الشريان متفوقة الغدة الدرقية ، وبحلول نهاية هذا الإجراء سوف يكون على نحو فعال إجراء الربط الكامل الذي هو نموذج مختلف إلى حد كبير.
- التعادل خارج الشرايين السباتية الداخلية والقذالي عقدة واحدة باستخدام نفس التقنية.
- التحقق من موقف والغرز سالكية من الشريان الدرقي العلوي.
- التقريبية الجلد والبشرة وثيقة باستخدام كمية صغيرة من النسيج ميند.
- الفئران مكان في الغرفة الاحترار حتى الشفاء. وعادة ما يستغرق التعافي 30 إلى 60 دقيقة.
- وينبغي أن تدار على جرعة واحدة من البوبرينورفين (0.1mg/kg) فورا بعد الجراحة إذا كان يستخدم التخدير لا توفر لتخفيف الآلام لفترة طويلة (أي استنشاق isoflurane) أو إذا كان الحيوان هو في محنة في غضون الساعات ال 24 الأولى. في تجربتنا ، وجرعة الكيتامين تديرها يوفر للتخدير للوعي كاف عند إجراء عملية جراحية من قبل جراح من ذوي الخبرة وليس هناك حاجة إلى مزيد من وعي.
2. فحص الموجات فوق الصوتية السباتي
- للتحقق من صحة ما إذا كان الربط الجزئي الناجم عن اضطراب تدفق ، ينبغي فحص تدفق السباتي يوم واحد بعد الربط
- تحريض التخدير مع isoflurane -- يمكن استخدام التخدير مربع تحريض إذا لزم الأمر
- مكان تخدير الفئران في مرحلة التصوير ، وحتى الجانب الشرقي
- الشريط الأسلحة والساقين لاستشعار ECG على خشبة المسرح والتصوير
- Defoliate الرقبة عن طريق تطبيق الليبرالية من نير (فقط مطلوب هذه الخطوة إذا لم تفعل لإجراء عملية ربط)
- إدراج مقياس الحرارة المستقيم لتسجيل درجات الحرارة
- جل تطبيق الارتداد إلى الرقبة
- تبدأ في وضع - B.
- وينبغي أن يكون التصوير الطائرة 90 درجة (مقبض على التحقيق يجب أن يشير في اتجاه الأنف من الماوس)
- دقق في أقل من الرقبة الماوس حتى يتم الحصول على الصورة.
- التلاعب مرحلة اليسار واليمين حتى القصبة الهوائية (منتصف خط الهيكل) يتم التعرف
- تحديد الشريان السباتي الأيسر مشتركة
- إمالة مرحلة التصوير بحيث يتم إنشاء زاوية بين الطائرة والتصوير والسباتي. لمزيد من هذه الزاوية ، وأقوى إشارة سوف يكون دوبلر.
- مكان نبض موجة دوبلر في منتصف السباتي الأيسر مشتركة.
- استخدام تصحيح زاوية حسب الحاجة.
- تكرار القياسات على الشريان السباتي المشترك الصحيح.
- وربط نجاح جزئي السباتي يؤدي إلى انخفاض عام في التدفق (~ 80-90 ٪) في الشريان السباتي الأيسر مقارنة المشتركة مع الجانب الأيمن ، مع تراجع تدفق نحو مدخل الشريان الأورطي أثناء انبساط.
- مرة واحدة وقد تم الحصول على صور مرضية ، إيقاف التخدير ، ومحو صدى الجل قبالة الفئران والجرذان خالية من الدقة الشريطtraints. مكان الفئران في غرفة الإنعاش تحسنت.
3. بمعزل عن الحمض النووي الريبي باطنة الشريان السباتي
- التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 وفقا لبروتوكول IACUC المؤسسية
- الشريط الكفوف على منشفة ورقية.
- قطع الجلد من الفأرة من البطن إلى أعلى الصدر.
- فتح جدار البطن أسفل القفص الصدري مع زوج من مقص حاد.
- رفع القص مع ملقط وقطع الحجاب الحاجز ، ثم قطع بعيدا القفص الصدري لكشف القلب.
- قطع الوريد الأجوف مع المقص.
- يروي الضغط (120 مم زئبق) لمدة 2 إلى 3 دقائق مع المالحة العادية التي تحتوي على 10 وحدة / مل الهيبارين من خلال البطين الأيسر حتى الرئتين والكبد تصبح شاحبة.
- قطع جلد الرقبة وإزالة كل الدهون والعضلات والأنسجة الضامة حتى تتعرض الشرايين السباتية.
- مكان الماوس تشريح تحت المجهر.
- ثقب حفرة الحق دون ربط مواقع في الشريان السباتي الأيسر لنضح الثانية.
- يروي الضغط مرة أخرى للدقيقة 1 مع ~ المالحة العادية التي تحتوي على 10 وحدة / مل الهيبارين من خلال البطين الأيسر ، والتأكد من الاطلاع جيدا على الشريان السباتي الأيسر.
- باستخدام الملقط غيض الجميلة ومقص صغير في الربيع ، وإزالة بعناية الأنسجة المحيطة بالمناطق المحيطة carotids براني. يجب الحرص على عدم الضغط أو تمدد carotids خلال هذه الخطوة التنظيف.
- قطع الشريان السباتي الأيسر بين قوس الأبهر ونقاط الربط فوق انشعاب السباتي.
- قطع الشريان السباتي الأيمن بين نقطة الشريان تحت الترقوة اليمنى والتشعب والتفرع السباتي.
- نقل إلى طبق carotids ملم الثقافة 35 ، التي تحتوي على الجليد الباردة HBSS. إذا لزم الأمر ، وإزالة أي بعناية المتبقية شبه براني الأنسجة.
- تحضير حقنة الانسولين (3 / 10 المحاقن مل) مع إبرة 29g عن طريق ملء مع 150 ميكرولتر QIAsol العازلة تحلل (Qiagen) لكل السباتي.
- إدراج بعناية غيض من الإبرة في واحدة من نهاية السباتي.
- في حين عقد السباتي ورأس الإبرة مع ملقط ، بسرعة (~ 1 ثانية) تدفق العازلة تحلل QIAsol (150 ميكرولتر) في أنبوب 1.5ml (البطانية شطافة).
- شطف بقايا السباتي (وسائط + البرانية) مرة واحدة في HBSS ، ووضعها في أنبوب 1.5 مل ، والمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل.
- ثم يتم استخدام البطانية شطافة وبقايا مجمدة + باطنة للعزلة أو وسائل الإعلام باستخدام الحمض النووي الريبي البرانية miRNeasy مصغرة مجموعة (QIAGEN) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
4. ممثل النتائج :
نحن ligated جزئيا الماوس الأيسر وأجريت الشرايين السباتية والفحص بالموجات فوق الصوتية من أصل واحد اليوم التالي الإجراء. كما هو مبين في الشكل 1 ، وربط نجاح جزئي يقلل من سرعة تدفق الدم ويعكس التدفق (تدفق بانزعاج) في الشريان السباتي الأيسر المشترك خلال انبساط. الربط الجزئي للAPOE الفئران (KO) بالضربة القاضية يرافقه الحمية عالية الدهون يؤدي الى تصلب الشرايين قوية في الشريان السباتي الأيسر المشتركة (الرابطة) ، ولكن ليس في الشريان السباتي الأيمن المقابل ، لمدة أسبوعين (الشكل 2). الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من البطانية السباتي يحتوي على جينات علامة البطانية مثل PECAM - 1 ، في حين خالية من الإنسي السلس جينات الخلايا العضلية علامة مثل SMA (الشكل 3).
الشكل 1 : رسم تخطيطي للتشريح وعمليات ربط الشريان السباتي : وligated ثلاثة فروع من الشريان السباتي الأيسر المشتركة (الرابطة) [الشريان السباتي الخارجي (ECA) ، الشريان السباتي الداخلي (ICA) ، والشريان القذالي (OA)] ، بينما يترك الشريان متفوقة الغدة الدرقية (STA) مفتوحة.
الشكل 2 : الموجات فوق الصوتية والصور تظهر ملامح سرعة تدفق وتكشف عن أن ربط جزئي يدفع عكس تدفق (المشار إليها السهام) في LCA أثناء انبساط. تدفق في انديانابوليس لم يتغير بعد ربط.
الشكل 3 : الربط الجزئي واتباع نظام غذائي غني بالدهون يدفع بسرعة تصلب الشرايين في فئران LCA KO APOE APOE الفئران KO ligated كانت جزئيا وتغذية حمية غنية بالدهون لمدة 1 إلى 3 أسابيع. وكانت ملطخة أقسام المجمدة من الرابطة مع النفط الأحمر - O.
الشكل 4. أسلوب إعداد RNA باطنة. RNA باطنة وسطي + براني (م + أ). تم الحصول على الحمض النووي الريبي من الشام ، وتعمل الرابطة في انديانابوليس C57BL / 6 الفئران وقد تم تحليل الرناوات بواسطة شبه كمي RT - PCR (A) وqPCR (B ، C) لPECAM - 1 و α SMA - 18S به باعتباره الرقابة الداخلية. شريط الرسوم البيانية ويعني ± SEM ، ن = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الإجراء ، والتحديد السليم لفروع كل من الشريان السباتي المشترك بما في ذلك الشريان السباتي الخارجي ، السباتي الداخلي ، الشريان القذالي ومتفوقة شريان الغدة الدرقية أمر ضروري. من المهم أيضا للتحقق من نمط تدفق باستخدام الموجات فوق الصوتية كما هو موضح. في أيدي ذوي الخبرة لدينا ، لدينا نسبة نجاح العمليات الجراحية ربط جزئي استنادا إلى دراسات بالموجات فوق الصوتية لأكثر من 500 من الفئران هو أفضل من 90 ٪. من أجل التحضير السباتي RNA باطنة ، فمن المهم أن تولي اهتماما لظهور السباتي بعد خطوة نضح الأولى. إذا كان هناك دليل على انسداد تدفق في الشريان السباتي الأيسر المشترك في هذه النقطة ، فإننا نوصي لا تستخدم هذه العينات لإجراء مزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح HL87012 (HJ) ، HL75209 (HJ) ، UO1HL80711 (DH ، DG ، HJ) ، ومشروع جامعة من الطراز العالمي (HJ) من وزارة العلوم والتكنولوجيا والتعليم في كوريا الجنوبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter Internationl Inc. | 2B1323 | |
| Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) | Tyco Healthcare, Covidien | 8881600145 | |
| HBSS | Cellgro | 21-023 | |
| miRNeasy mini kit (including, QIAzol) | Qiagen | 217004 | |
| Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System | VisualSonics, inc. | a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice | or similar system |
| 6-0 Silk Suture, sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5675 | or similar |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veterinary | 07-856-7946 |
References
- Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).
- Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).
- Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
