Summary
Это описывает частичную операцию перевязки сонных, что вызывает нарушение условий потока и последующего развития атеросклероза (в две недели) с intraplaque нео-васкуляризации (в четыре недели) в мышь общей сонной артерии. Мы также описывают новый метод РНК изоляции от сонных интима, обеспечивая высокую чистоту эндотелиальных РНК.
Abstract
Несмотря на известные тесные связи, прямые доказательства, связывающие возмущенного течения в атерогенеза не хватало. Недавно мы использовали модифицированную версию сонной частичные методы перевязки [1,2], чтобы показать, что она остро вызывает низкий и колебательного потока условия, два ключевых характеристик возмущенного течения, в мыши общей сонной артерии. Используя эту модель, мы представили прямые доказательства того, что возмущенного течения действительно приводит к быстрой и надежной развитие атеросклероза в аполипопротеине мыши нокаутом E [3]. Мы также разработали метод подготовки эндотелиальных РНК с высокой чистоты от мыши сонных интима [3]. Используя эту модель мыши и метод, мы обнаружили, что частичная перевязка причины дисфункции эндотелия в неделю, а затем надежный и быстрый атеромы формирования в две недели в мышиной модели гиперлипидемией наряду с особенностями образования комплекса поражения, такие как intraplaque неоваскуляризации на четыре недели. Этот быстрый
Protocol
1. Частичное перевязки левой сонной артерии
- Мыши используются на ~ 8-недельного возраста. Вес мышей, рекомендуется быть не менее 18 граммов.
- Стерилизуйте инструменты для 30-секундного в бисер стерилизатор инструмента и дать остыть
- Вызвать наркоз с кетамином (80mg/kg) и Ксилазин (10mg/kg) внутрибрюшинного (ф) инъекции или альтернативные анестезии утвержденные IACUC. Для IP-инъекции, вводят мыши в левой низкой квадранте живота.
- Наведите в потеплении камеры до полного наркоза. Проверьте глубину анестезии с ответом до пят крайнем случае.
- Место мыши на хирургическом этапе, в спине (до живота стороны) позицию. Лента передние лапы ладонями вверх, а задние лапы единственным вниз на сцену.
- Нанесите количество удаления волос агента (например Наир) до шеи между нижней челюстью и грудины. Мягко массируйте, пока все волосы удаляются.
- Очистите для удаления волос агента и применять либеральные количество Бетадин для depilated области.
- Подготовка 1 дюйм длиной разделах 6-0 шелковых шва на перевязку. Каждая мышь понадобятся две части шва.
- Используя острый небольшие ножницы, чтобы 4-6мм вертикальный разрез в середине шеи. Оба кожи и основной фасции должны быть сокращены.
- Перемещение левой околоушной железы от средней линии слева и начните прямо рассекает только право трахеи. Вы должны быть в состоянии определить пульсирующий левой общей сонной легко.
- Следуйте общей сонной каудально, пока не найдете бифуркации.
- Грубо говоря рассекать бифуркации раскрыть следующие четыре дистальных ветки левой общей сонной артерии: внешний сонной артерии, внутренней сонной артерии, затылочной артерии и артерии превосходной щитовидной железы. Эти суда, особенно превосходное щитовидной железы, может быть хрупкой. Будьте очень осторожны со своими рассечение.
- Галстук от наружной сонной ВЫШЕ превосходной щитовидной использованием 6-0 шелковые нити. Чтобы сделать это, сдать один пинцет под артерию и захватить кусок нарезанные шва с помощью вашего друга щипцами. Осторожно потяните шва проходить под артерии. Галстук прочно избегая любых окружающих тканей, попав в узел. Если вы связываете ниже взлет превосходной артерия щитовидной железы, к концу процедуры вы будете эффективно выполнить полную перевязки которая существенно отличается модель.
- Галстук от внутренней сонной артерии и затылочной с одним узлом, используя тот же метод.
- Проверьте положение швов и проходимость высшего артерии щитовидной железы.
- Приблизительная кожи и близко кожи, используя небольшое количество ткани-Менд.
- Место мышей в камере потепление до выздоровления. Восстановление как правило, занимает от 30 до 60 минут.
- Разовая доза бупренорфина (0.1mg/kg) следует вводить сразу после операции, если анестезии не обеспечивает длительное облегчение боли (то есть вдыхания ИФ), или если животное находится в бедственном положении в течение первых 24 часов. По нашему опыту, кетамин дозы для анестезии обеспечивает достаточное обезболивание, когда операция проводится опытным хирургом и не далее обезболивания не требуется.
2. Каротидная УЗИ
- Чтобы проверить, является ли частичная перевязка индуцированных возмущенного течения, сонных поток должен быть рассмотрен в один прекрасный день после перевязки
- Вызвать анестезии с изофлуран - наркозно поле индукции могут быть использованы в случае необходимости
- Место под наркозом мышей на стадии визуализации, живот вверх
- Лента руки и ноги к ЭКГ датчик на стадии визуализации
- Уничтожать растительность шею либерального применения Наир (этот шаг нужен только если не было сделано для лигирования процедуры)
- Вставьте ректального термометра для записи температуры
- Применить Эхо гель для шеи
- Начало в B-режиме.
- Изображениями самолет должен составлять 90 градусов (кнопка на зонд должен указывать на носу мыши)
- Нижний датчик мыши на шее, пока изображение получается.
- Манипулирование этапе левая и правая, пока трахея (средней линии структуры) отождествляется
- Определить левой общей сонной артерии
- Tilt стадии визуализации так, чтобы угол между плоскостью создан изображений и сонной артерии. Чем больше этот угол, тем сильнее сигнал доплеровского будет.
- Место пульсовой волны Доплера в середине левой общей сонной артерии.
- Используйте угол коррекции по мере необходимости.
- Повторите измерения на правой общей сонной артерии.
- Успешное частичной перевязки сонных приведет к общему сокращению потока (~ 80-90%) в левой общей сонной по сравнению с правой стороны, с поворотом потока на входе аорты во время диастолы.
- После удовлетворительного изображения были получены, выключите анестезии, протрите эхо-гель от мышей и мышей свободными от ленты разрешениемtraints. Место мышей в подогретом восстановления камеры.
3. Интимы РНК изоляции от сонной
- Жертва мышей CO 2 ингаляции в соответствии с институциональными протокол IACUC
- Лента лапы к бумажным полотенцем.
- Разрежьте кожу мыши из брюшной полости в верхнюю часть грудной клетки.
- Открытое брюшной стенки ниже грудной клетки с резким ножницы.
- Поднимите грудины щипцами и сократить диафрагму, затем срезаем грудной клетки подвергать сердце.
- Вырезать полой вены ножницами.
- Давление заливать (120 мм рт.ст.) в течение 2 до 3 минут с физиологическим раствором, содержащим 10 ед / мл гепарина через левый желудочек, пока легкие и печень стала бледной.
- Разрежьте кожу шеи и удалить весь жир, мышцы и соединительные ткани до сонной артерии подвергаются.
- Наведите под рассекает микроскопом.
- Прокол отверстие прямо под перевязки сайтов в левой сонной для второй перфузии.
- Давление заливать снова в течение ~ 1 мин с физиологическим раствором, содержащим 10 ед / мл гепарина через левый желудочек, убедившись, что левой сонной хорошо ознакомились.
- Использование тонких пинцетов кончик и маленькие ножницы весной, осторожно удалите пригородных адвентиции тканей, окружающих сонных артерий. Будьте осторожны, чтобы не сжать или растянуть сонных артерий во время этой стадии очистки.
- Вырезать левой сонной артерии между дуги аорты и перевязки пунктов выше бифуркации сонной артерии.
- Вырезать правой сонной артерии между правой подключичной артерии точке ветвления и бифуркации сонной артерии.
- Передача сонных артерий до 35 блюдо культуры мм, содержащий ледяной HBSS. Если необходимо, тщательно удалить все оставшиеся пригородных адвентиции ткани.
- Подготовка инсулиновый шприц (3 / 10 мл шприц) с иглой 29G, заполнив с 150 мкл буфера для лизиса QIAsol (Qiagen) за каждый сонной артерии.
- Осторожно вставьте кончик иглы в один конец сонной артерии.
- Удерживая сонных и кончике иглы с пинцетом, быстро (~ 1 сек) заподлицо QIAsol буфера для лизиса (150 мкл) в 1,5 мл трубки (интиму элюата).
- Промыть сонной остатки (медиа + адвентиции) один раз в HBSS, положить его в 1,5 мл трубки и оснастки заморозить в жидком азоте.
- Intima элюата и замороженные остатки затем используются для интимы или медиа + адвентиции РНК изоляции использованием miRNeasy мини-комплект (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя.
4. Представитель Результаты:
Мы частично лигируют мышью левой сонной артерии и ультразвуковое исследование было проведено на следующий день после процедуры. Как показано на рисунке 1, успешные частичной перевязки уменьшает скорость кровотока и меняет поток (возмущенного течения) в левой общей сонной артерии во время диастолы. Частичное перевязки ApoE нокаут (KO) мышей сопровождается высоким содержанием жиров вызывает атеросклероз надежные в левой общей сонной артерии (ДМС), но не в контралатеральной сонной право, на две недели (рис. 2). РНК собраны из сонных интима содержит эндотелиальных генов-маркеров, таких как PECAM-1, в то время свободны от медиальной гладкие мышечные клетки генов-маркеров, таких как-SMA (рис. 3).
Рисунок 1: Схема сонной анатомии и перевязки: Три ветви левой общей сонной артерии (ДМС) [Внешняя сонной артерии (ЭКА), внутренней сонной артерии (ВСА) и затылочной артерии (ОА)] лигировали, оставив при этом превосходное артерии щитовидной железы (STA) открытым.
Рисунок 2: ультразвуковые изображения показывают профилей скорости течения и выявить, что частичная перевязка вызывает поток разворота (указаны стрелками) в ДМС во время диастолы. Поток в RCA остается неизменной после перевязки.
Рисунок 3: Частичное перевязки и высоким содержанием жиров быстро вызывает атеросклероз ДМС из ApoE мышей KO ApoE KO мышей были частично лигируют и кормили высоким содержанием жиров от 1 до 3 недель.. Замороженные срезы от ДМС окрашивали Нефть-красно-вывода.
Рисунок 4. Метод интимы подготовки РНК. Интимы РНК и медиальной + адвентиции (т +) РНК были получены из ложнооперированных RCA и ДМС в C57BL / 6 мышей. РНК анализировали с помощью полуколичественного ОТ-ПЦР (А) и КПЦР (B, C) для PECAM-1 и α-SMA использованием 18 лет в качестве внутреннего контроля. Бар графы среднее ± SEM, п = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой процедуре, соответствующей идентификации всех ветвей общей сонной в том числе наружной сонной, внутренней сонной артерии, затылочной артерии и артерии щитовидной превосходной имеет важное значение. Важно также, чтобы проверить картины течения с помощью ультразвука, как показано. В наших опытных руках наших успеха частичной операции перевязки на основе ультразвукового исследования более 500 мышей лучше, чем 90%. Для сонной интимы препаратов РНК, важно обратить внимание на появление сонных после первого шага перфузии. Если есть доказательства засорена левой общей сонной на данный момент, мы не рекомендуем использовать эти образцы для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование NIH гранты HL87012 (HJ), HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, DG, HJ) и World Class университета Проекта (ГП) из министерства науки, технологий и образования Южной Кореи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter Internationl Inc. | 2B1323 | |
| Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) | Tyco Healthcare, Covidien | 8881600145 | |
| HBSS | Cellgro | 21-023 | |
| miRNeasy mini kit (including, QIAzol) | Qiagen | 217004 | |
| Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System | VisualSonics, inc. | a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice | or similar system |
| 6-0 Silk Suture, sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5675 | or similar |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veterinary | 07-856-7946 |
References
- Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).
- Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).
- Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
