Summary
Detta beskriver en partiell halspulsådern ligation kirurgi, som orsakar störd flödesförhållanden och påföljande åderförkalkning utveckling (två veckor) med intraplaque neo-vaskularisering (i fyra veckor) i musen gemensamma halspulsådern. Vi beskriver också en ny metod av RNA isolering från halspulsådern Intima, vilket ger hög renhet endothelial RNA.
Abstract
Trots den välkända nära samarbete har direkta bevis för sambandet mellan störd flöde till aterogenes saknats. Vi har nyligen använde en modifierad version av halspulsådern partiella ligation metoder [1,2] för att visa att det akut inducerar låg och oscillerande flödesförhållanden, två viktiga egenskaper störd flöde, i musen gemensamma halspulsådern. Med hjälp av denna modell har vi tillhandahållit direkta bevis som störde flödet verkligen leder till snabb och robust åderförkalkning utveckling i apolipoprotein E Knockoutmusens [3]. Vi utvecklade också en metod av endotelceller RNA förberedelser med hög renhet från musen halspulsådern Intima [3]. Med denna musmodell och metod, fann vi att delvis ligation orsakar endoteldysfunktion på en vecka, följt av en stark och snabb aterom formation i två veckor i en hyperlipidemic musmodell tillsammans med inslag av komplexa lesioner som intraplaque kärlnybildning med fyra veckor. Den snabba
Protocol
1. Partiell ligation av vänster halspulsådern
- Möss används vid ~ 8 veckors ålder. Vikten av möss rekommenderas att vara minst 18 gram.
- Sterilisera instrumenten för 30 tvåa i kula instrumentet autoklav och låt svalna
- Inducera anestesi med ketamin (80mg/kg) och Xylazine (10mg/kg) intraperitoneal (ip) injektion eller alternativt anestesi som godkänts av IACUC. För ip injektion, injicera musen i vänster låg kvadranten av buken.
- Placera musen i ett värmande kammare tills det är helt sövd. Kontrollera djup anestesi med svar på tå nypa.
- Placera musen på ett kirurgiskt stadium, i liggande (magen uppåt) position. Tejpa fram-tassarna handflatorna uppåt och hind-tassar sula ner till scenen.
- Applicera liberala mängd hårborttagningsprodukter medel (t.ex. Nair) till halsen mellan underkäke och bröstbenet. Massera försiktigt tills allt hår är bort.
- Rengör hårborttagningsprodukter agenten och tillämpa liberala mängd Betadine till avhåras området.
- Förbered 1 tum långa sektioner av 6-0 siden sutur för ligations. Varje mus kommer att behöva två bitar av sutur.
- Med en vass liten sax, gör en 4-6mm vertikala snitt i mitten av halsen. Både huden och den underliggande fascia behöva sänkas.
- Flytta vänster öronspottkörteln från mittlinjen till vänster och börja rakt på sak dissekera precis rätt i luftstrupen. Du ska kunna identifiera den pulserande vänster gemensamma halspulsådern lätt.
- Följ den gemensamma halspulsådern caudally tills du hittar bifurkation.
- Rakt på sak dissekera bifurkationen att exponera följande fyra distala grenar från vänster gemensamma halspulsådern: yttre halspulsådern, carotis interna, skallbenet artär och överlägsen sköldkörtel artär. Dessa fartyg, särskilt överlägsen sköldkörtel, kan vara bräcklig. Var mycket försiktig med dina dissekering.
- Knyt av den externa halspulsådern OVAN överlägsna sköldkörteln med 6-0 siden sutur. För att göra detta, passera en pincett under artär och ta en bit av färdigskurna sutur med hjälp av dina andra tång. Dra försiktigt ut suturen att passera under artären. Knyt fast undvika omgivande vävnad fastnar i knuten. Om du knyter under starten av den överlägsna sköldkörtel artären, i slutet av proceduren blir du faktiskt har utfört en komplett ligation vilket är en väsentligt annorlunda modell.
- Knyt bort carotis interna och nacken artärer med en knut med samma teknik.
- Kontrollera positionen för suturer och öppetståendet av högsta sköldkörtel artär.
- Ungefärlig huden och nära huden med en liten mängd vävnad-derar.
- Placera möss i en värmande kammaren tills dess återhämtning. Återhämtning tar normalt 30 till 60 minuter.
- En engångsdos av buprenorfin (0.1mg/kg) bör ges omedelbart efter operationen om narkos som används inte ger långvarig smärtlindring (dvs. inhaleras isofluran) eller om djuret är i nöd inom de första 24 timmarna. Enligt vår erfarenhet ger Ketamin dosen för anestesi tillräcklig smärtlindring när operation utförs av erfaren kirurg och inga ytterligare smärtlindring behövs.
2. Halspulsådern ultraljudsundersökning
- För att validera om den partiella ligation inducerad störd flöde, bör halspulsådern flödet undersökas en dag efter ligering
- Inducera anestesi med isofluran - anestesi induktion boxen skulle kunna användas om det behövs
- Placera sövda möss på bildbehandling scenen, magen uppåt
- Tejp armar och ben för att EKG-sensor på bildbehandling scenen
- Avlöva halsen av liberala tillämpningen av Nair (detta steg behövs bara om det inte redan gjort för ligering förfarande)
- Sätt rektal termometer för att spela in temperaturen
- Applicera Echo gel för nacken
- Starta i B-läge.
- Imaging planet ska vara 90 grader (ratten på sonden ska peka mot näsan för musen)
- Lägre sond på musen halsen tills bilden erhålls.
- Manipulera steg vänster och höger tills luftstrupen (mittlinjen struktur) identifieras
- Identifiera vänster gemensamma halspulsådern
- Tilt avbildning skede så att en vinkel bildas mellan avbildning planet och halspulsådern. Ju större denna vinkel, desto starkare Doppler-signalen kommer att bli.
- Sätt pulsen våg Doppler i mitten av vänster gemensamma halspulsådern.
- Använd vinkel korrigering som behövs.
- Upprepa mätningar på höger gemensamma halspulsådern.
- Framgångsrika partiella halspulsådern ligation kommer att resultera i total minskning av flödet (~ 80-90%) i den vänstra gemensamma halspulsådern jämfört med den högra sidan, med återläggning av flödet mot aorta inlopp under diastole.
- När tillfredsställande bilder har erhållits, stäng av anestesi, torka eko gel bort möss och möss från band restraints. Placera möss i uppvärmda återhämtning kammare.
3. Intimans RNA isolering från halspulsådern
- Offra möss med CO 2 inandning enlighet med de institutionella IACUC protokollet
- Tejpa tassar på en pappershandduk.
- Skär huden på möss från buken till toppen av bröstkorgen.
- Öppna bukväggen nedanför bröstkorgen med en vass sax.
- Lyft bröstbenet med pincett och skär mellangärdet, sedan skära bort bröstkorgen att exponera hjärtat.
- Skär vena cava med en sax.
- Tryck BEGJUTA (120 mmHg) i 2 till 3 min med vanlig koksaltlösning innehållande 10 enheter / ml heparin via vänster kammare tills lungorna och levern blir blek.
- Skär huden på halsen och ta bort alla fett, muskler och bindväv tills halspulsåder exponeras.
- Placera musen under ett dissekera mikroskop.
- Punktera ett hål precis under ligation platser i vänster halspulsådern för andra perfusion.
- Trycket BEGJUTA igen för ~ 1 min med vanlig koksaltlösning innehållande 10 enheter / ml heparin via vänster kammare, att se till vänster halspulsådern är väl läste igenom.
- Använda en fin spets pincett och en liten sax våren försiktigt bort peri-adventitial vävnad som omger halspulsådern. Var noga med att inte pressa eller sträcka halspulsådern under rengöringen steg.
- Klipp till vänster halspulsådern mellan aortabågen och de punkter ligation över halspulsådern bifurkation.
- Skär rätt halspulsådern mellan höger subclavia avgrening och halspulsådern bifurkation.
- Överför halspulsådern med en 35 mm kultur maträtt, som innehåller iskall HBSS. Vid behov försiktigt bort återstående peri-adventitial vävnad.
- Förbered en spruta (3 / 10 ml spruta) med en 29g nål genom att fylla med 150 l QIAsol lyseringsbuffert (Qiagen) för varje halspulsådern.
- Försiktigt in spetsen på nålen i ena änden av halspulsådern.
- Medan du håller halspulsådern och spetsen på nålen med en pincett, snabbt (~ 1 sek) spola QIAsol lyseringsbuffert (150 l) i ett 1,5 ml rör (intima eluat).
- Skölj halspulsådern överblivna (media + adventitia) en gång i HBSS, lägga den i ett 1,5 ml rör och snap-frysa i flytande kväve.
- Intima eluat och den frusna överblivna används sedan för intimans eller media + adventitia RNA isolering med miRNeasy mini-kit (QIAGEN) enligt tillverkarens anvisningar.
4. Representativa resultat:
Vi knyts ihop delvis musen vänster halspulsåder och ultraljudsundersökning genomfördes en dag efter ingreppet. Som visas i figur 1, minskar framgångsrika partiella ligation hastighet blodflödet och vänder flöde (störd flöde) i vänster gemensamma halspulsådern under diastole. Partiell ligatur av ApoE knockout (KO) möss tillsammans med en fettrik kost inducerar robust åderförkalkning i vänster gemensamma halspulsådern (LCA), men inte i det kontralaterala högra halspulsådern, med två veckor (figur 2). RNA hämtas från halspulsådern Intima innehåller endotelceller markörgener som PECAM-1, medan fri från mediala smidig markör muskelcellen gener som en-SMA (Figur 3).
Figur 1: Schematisk av halspulsådern anatomi och ligations: Tre grenar av det vänstra gemensamma halspulsådern (LCA) [extern halspulsådern (ECA), carotis interna (ICA), och occipital artär (OA)] var knyts ihop, medan den överlägsna sköldkörteln artär (STA) öppen.
Figur 2: ultraljudsbilder på Visa profiler strömningshastighet och avslöjar att partiella ligation inducerar flödesväxlingen (indikeras med pilar) i LCA under diastole. Flöde i RCA förblir oförändrat efter ligatur.
Figur 3: Partiellt ligation och fettrik kost inducerar snabbt åderförkalkning i LCA av ApoE KO möss ApoE KO möss delvis knyts ihop och matade fettrik kost för 1 till 3 veckor.. Frysta snitt från LCA färgades med Oil-Red-O.
Figur 4. Metod för intimans RNA beredning. Intimans RNA och mediala + adventitial (m + A) RNA erhölls från bluff drivs RCA och LCA i C57BL / 6 möss. RNA analyserades med semi-kvantitativ RT-PCR (A) och qPCR (B, C) PECAM-1 och α-SMA med 18 år som en intern kontroll. Stapeldiagram är medelvärde ± SEM, n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid detta förfarande är korrekt identifiering av alla grenar av den gemensamma halspulsådern inklusive externa halspulsådern, carotis interna, skallbenet artär och överlägsen sköldkörtel artär viktigt. Det är också viktigt att kontrollera flödet mönster med hjälp av ultraljud som visade. I våra erfarna händer, är vår framgång partiella ligation operationer baseras på ultraljud studier av mer än 500 möss bättre än 90%. För halspulsådern intimans RNA beredningar, är det viktigt att uppmärksamma utseendet på halspulsådern efter det första perfusion steget. Om det finns tecken på flödet stopp i vänster gemensamma halspulsådern på denna punkt, rekommenderar vi inte dessa prover för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från NIH bidrag HL87012 (HJ), HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, GD, HJ) och ett World Class universitet Project (HJ) från ministeriet för vetenskap, teknologi och utbildning i Sydkorea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter Internationl Inc. | 2B1323 | |
| Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) | Tyco Healthcare, Covidien | 8881600145 | |
| HBSS | Cellgro | 21-023 | |
| miRNeasy mini kit (including, QIAzol) | Qiagen | 217004 | |
| Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System | VisualSonics, inc. | a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice | or similar system |
| 6-0 Silk Suture, sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5675 | or similar |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veterinary | 07-856-7946 |
References
- Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).
- Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).
- Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
