Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей

Summary

Удаление гена и белка гиперэкспрессия общие методы изучения функций белков. В этой статье мы опишем протокол для анализа фенотипа развития в зависимости от концентрации белка на население и одноклеточных уровней в

Abstract

Удаление гена и белка гиперэкспрессия общие методы изучения функций белков. В этой статье мы опишем протокол для анализа фенотипа развития в зависимости от концентрации белка на население и одноклеточных уровней в

Protocol

А. культуры клеток и белка индукционные

В этом разделе описывается культура клеток условиях клеточного цикла синхронизации с нокодазолом, после индукции экспрессии белка с регулируемой промоутер в клетках дрожжей.

1. Дикий штамм дрожжей типа W303 (leu2-3, 112 TRP1-1 can1-100 URA3-1 ade2-1 his3-11, 15) превращается с высокой копию (2μ) плазмидной ДНК, которая содержит наши гены, представляющие интерес (ENTH2) под контролем из-метионин репрессируемый промотора (MET25). 2 мМ метионин достаточно, чтобы подавить активность промотора, в то время как средства массовой информации не хватает метионина позволяет максимальное выражение. Таким образом, диапазон метионин концентрации могут быть использованы для выражения белка на желаемом уровне. 1 Преобразование ДНК плазмиды в клетки W303 делается с помощью LiAc-TE методом в соответствии со стандартными процедурами. ²
   Примечание: Этот эксперимент должен выполнять растущие клетки в течение ночи в присутствии 2 мМ метионин для обеспечения экспрессии белка только на фоновые уровни. На следующее утро, экспрессии белка должно быть вызвано ресуспендирования клеток в средах без метионина сразу после клеточного цикла синхронизации (около 4 ч). Тем не менее, мы обнаружили, что ENTH2 зависит от клеточного деления фенотип индуцирована только после того, значительная концентрация ENTH2 создала в клетках (как правило, после 4-6ч белка индукции ^3), что делает ход времени для анализа всех проявлений фенотипа очень длительный (не менее 16 ч). Мы обнаружили, что растущие клетки в течение ночи в присутствии 0,2 метионин подавляет морфологического фенотипа, но позволяет подкритической концентрации белка, который может быть быстро увеличена до фенотипа вызывающие уровней при передаче на средства массовой информации не хватает метионина. Это дает возможность детального анализа тяжелых проявлениях дефекта деление клеток в относительно короткий период времени. Мы поэтому рекомендуем экспериментатора определить метионин концентрации, к югу от порога фенотипа индукции от случая к случаю.
2. Выберите шесть колоний от пластины, содержащей недавно трансформированных клеток и привить в 50 мл селективных средах с 0,2 метионина в стерилизованные коническую колбу с использованием стандартных стерильных техник. Выдержите в течение ночи при 30 ° С в при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. (Для получения дополнительной информации на стандартных условиях культивирования дрожжей, см. ссылки. 4)
3. На следующее утро, оценить плотность клеток путем измерения оптической плотности культуры на 600 нм. Передача эквивалентно 20 OD _{600 нм} клеток в стерильную пробирку центрифуги и урожай вращается со скоростью 2200 оборотов в минуту для 5 мин при комнатной температуре.
4. Ресуспендируют клеток в YPD в концентрации 0,4 OD _{600 нм} / мл и добавить нокодазолом к конечной концентрации 15μg/ml от запаса 1mg/ml в ДМСО. Инкубируйте в течение 4 часов при температуре 30 ° C при встряхивании на 200rpm.
   Примечание: альтернативные методы, включая арест арестом в G0 фазе с использованием альфа-фактора или в G1-S фазы с использованием гидроксимочевины могут быть использованы. Мы обнаружили, что арест в митоз использованием нокодазолом прост и достаточно эффективным для наших целей.
5. После 4 часов, проверьте процент клеток арестован в митоза путем подсчета количества клеток с равным размером почки, рассматривая под микроскопом. Если арест на 90% выше, переходите к следующему шагу. В противном случае, поддержание клеток в нокодазолом до желаемого процента митотический арест достигнута.
6. Урожай клетки центрифугированием при 2200 оборотов в минуту для 5мин и промыть ледяной водой в три раза. После последней промывки, ресуспендируют осадок в селективных средах без метионина при плотности клеток ~ 0,5 OD _{600 нм} / мл. Передача половины объема клеток к новым стерильную пробирку и добавляют метионин для окончательного 0,2 мм концентрации. Это будет служить для контроля эффектов, связанных с базального уровня экспрессии белка. Это означает, что впервые точкой эксперимента (время = 0ч). Анализ клетки каждый час в течение 6 часов.

B. Анализ фенотипа развития

Примечание: Все анализ методов, описанных ниже, не должны быть выполнены одновременно.

Определение уровня экспрессии белка западными Blotting

1. На каждой временной точке, измеряют диаметр _{600 нм} культуры и урожая 2 OD _{600 нм} эквиваленты клеток путем центрифугирования при 2200 оборотов в минуту в течение 5 мин.
2. Ресуспендируют гранул в 1 мл стерильной воды и перевода подвески 1,5 мл трубки Эппендорф. Повторите центрифугирования для получения гранул. Аспирируйте супернатант.
3. Ресуспендируют гранул в 50 мкл SDS-PAGE Laemmli образца буфера (50 мМ Трис рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 2% β-меркаптоэтанола и 0,006% бромфенола синий). Добавить 50 мкл кислоты вымытые стеклянные бусы (0,2-0,4 мкм в диаметре) и вихревые течение 1 мин.
4. Отварите труб на 95 ° C тепла Блоск в течение 2 мин, вихревые снова в течение 30 секунд и возобновить кипячении в течение 5 минут. Замораживание белка образец до -20 ° C.
5. Выполнить белка образцов на 12% SDS-PAGE гель, передача на нитроцеллюлозные мембраны и выполнять западных промокательной соответствующие антитела для выявления белков, представляющих интерес. В этом примере мы зонда наличие гемагглютинина (HA), помеченный ENTH области путем инкубации с мышью анти-HA антитела (Covance, Принстон, штат Нью-Джерси) в разведении 1:2000 в одурманенный-Tween (1XPBS, 5% обезжиренного сухого молока , 0,1% Твин). HRP меткой антимышиного вторичные антитела (Pierce) в разведении 1:2500, а также в одурманенный-твин, допускается связывать первичными антителами на мембране в течение 1 ч при комнатной температуре. Supersignal Запад Пико Хемилюминесцентные субстрат используется для обнаружения HRP меткой анти антитела мыши.
6. Количественного определения уровней экспрессии белка по денситометрии.

В этом разделе описаны два способа отслеживания развития фенотипа в зависимости от повышения концентрации белка. Первый метод клеточной населения на основе, в то время как второй исследованиях на уровне одной клетки.

Количественная оценка делении клеток фенотипа и гибели клеток

1. В каждой временной точке, передача 1 мл клеточной суспензии в стерильную пробирку Эппендорф использованием стерильной техники и урожая клетки центрифугированием при 2200 оборотов в минуту в течение 5 мин.
2. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 70μl СМИ, а затем 30μl метиленовый синий с запасом 1mg/ml в стерильной воде. Метиленовый синий синий краситель, который жизненно важным становится бесцветным в восстановительной среде цитозоле, следовательно, омертвевших клеток можно определить по их голубого цвета.
3. Внесите ~ 6μl этой суспензии на предметное стекло чистым и место покровное за каплей. Пресс покровное осторожно, чтобы форма тонкий равномерный слой клеток между стекло.
4. Разделите покровное на 9 квадрантах и ​​принимать 3 кадров в квадранте, как показано на рис. 2. Число клеток / поле должно быть не больше 30 ячеек позволяют точно определять количественное. Каждый покровное может быть отображены в течение примерно 15 минут до пузырьков воздуха повреждения подготовки.
5. Подсчитайте количество клеток с фенотипом в стадии изучения. Дефект клеточного деления индуцированной на ENTH2 гиперэкспрессия приводит к гибели клеток и, следовательно, мы также рассчитываем количество мертвых клеток определены их голубого цвета.
6. Рассчитать процент фенотипические клеток.
7. Участок данных, как показано на рис. 3.

Визуализация фенотип конкретных дефектов с помощью флуоресцентной микроскопии

Cell-деление дефектных клеток, как это видно на ENTH2 гиперэкспрессия, часто характеризуются клеточной стенки дефекты и septin mislocalization3 (визуализируются как GFP-синтез белков). Клеточной стенки дрожжей начинающие могут быть легко визуализированы окрашиванием Calcofluor Белый (CFW), которое необратимо связывается с хитина в стенах дрожжевой клетки.

1. На каждой временной точке, аликвоту 1 мл культуры в стерильную пробирку Эппендорф и уборки клетки центрифугированием при 2200 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре.
2. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 1mg/ml CFW решение в стерильной водой и выдержать в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте.
3. Урожай клетки центрифугированием и промыть 3 раза 1X PBS.
4. Ресуспендируют осадок в 100 мкл 1X PBS и изображения под микроскопом с помощью УФ оптики (клеточная стенка) и FITC фильтр (GFP-septin) при увеличении 100X.
5. Количественная доля клеток с клеточный дефект стенки и septin mislocalization, выполнив следующие действия 4-6 в разделе B.2.1

В.3. Определение фенотипа развития на одном уровне ячейки: Покадровый видео микроскопии.

1. Чистая стекло с вогнутой депрессии с 70% спирта и дайте высохнуть на воздухе.
2. Отварите 0.06g агарозы в 5 мл селективных средах не хватает метионина в стерильную стеклянную трубку в микроволновой печи до агарозном растворяется полностью.
3. Быстро пипетки 200 мкл агарозном средах в слайд депрессии и инвертировать другой чистый предметное стекло над ним, убедившись, что нет пузырьков воздуха под ним.
4. Когда гель затвердевает, переместить слайд сверху плавно от депрессии слайд, сохраняя их поверхности параллельно во все времена. Это гарантирует, что поверхность кровати агарозы на одном уровне с поверхностью депрессии слайда. Чистая слайд область вокруг кровати агарозы с нежной ткани. Слайд готов к использованию.
5. В то время = 4 часа, передача 1 мл клеток из культуры стерильную пробирку Эппендорф и урожая путем центрифугирования при 2200 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре.
   Примечание: Рекомендуется позже точкой быть выбрана для обеспечения высокого уровня экспрессии белка, так что фенотип развитие обеспечено. Pilot эксперименты, необходимые для определяюэлектронной индукции раза случая к случаю.
6. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл свежей селективных средах без метионина.
7. Применить вазелин к краям покровного стекла. Затем поместите каплю суспензии клеток в центре кровати агарозы и распределяется равномерно, слегка нажав покровное над ними.
8. Печать края покровного стекла с вазелином и определить свою позицию, выравнивая края с лаком для ногтей. Подождите, пока лак высохнет.
9. Место слайд на нагревательный столик микроскопа и выберите поле, содержащее не более 10 клеток расположенных адекватно. Как клетки делятся, поле будет переполнен с течением времени.
10. Возьмите образ поля каждые 5 минут в течение ~ 5 часов. Фенотип прогрессии могут быть изучены, собирая изображения в фильм с помощью программного обеспечения ImageJ ( Rasband, WS, ImageJ, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Мэриленд, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

Примечание: Мы используем Zeiss Axiovert 200M микроскопом Zeiss Axiocam MRM монохромный цифровой камерой и объективом Carl Zeiss AxioVision получения изображений программного обеспечения (версия 4.4) для живого изображения клетки. Контроль температуры достигается за счет размещения слайдов на нагревательный столик поддерживаться на уровне 30 ° С PeCon Tempcontrol 37 устройства.

Для того, чтобы избежать повторного настройки фокуса неоднократно, это удобно для программирования программное обеспечение получения изображений на автоматическое получение нескольких Z-Stack изображения на каждой временной точке и выбрать изображения, наилучшим образом внимание позже, когда монтаж фильма. Некоторые программного обеспечения получения изображения имеют возможность автофокусом для экспериментов время курса. Удобно использовать эту опцию в если таковые имеются.

Дикие дрожжевые клетки типа лучше всего растут при 30 ° С, следовательно, контроль температуры имеет решающее значение. Для того, чтобы обеспечить надлежащую тепло, было бы полезно обеспечить внешний источник тепла в дополнение к подогревом стадии. Например, мы оставляем передается белый свет микроскопа в течение всего периода обработки изображений.

Важно также, чтобы избежать воздушных пузырей при подготовке постели агарозы и клеточной бутерброд. Воздуха внутри захваченного пузырьков при нагревании расширяется с течением времени и, как правило, толкать клетки от месторождения будучи в образ.

Кроме того, важно, чтобы индивидуальные позиции ячейки в поле не изменяется заметно в течение срока действия визуализации процесса, особенно в период переориентации попыток. Стабилизация изображения плагины доступны для ImageJ исправить небольшие сдвиги в клеточных позиции после фильма был собран. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / код / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Этот протокол описывает, как следить за развитием морфологических фенотип (дрожжевая клетка не в состоянии пройти надлежащее деление клеток) на белок гиперэкспрессия. При выполнении этой процедуры важно помнить, чтобы урожай дрожжевых клеток путем гранулирования в рекомендуемой скорости центрифугирования, как более высокие скорости может привести к повреждению клеток и неясными результатами. Метиленовый синий и белый Calcofluor следует добавить живые клетки непосредственно перед изображениями так как они являются токсичными. Эта процедура также может быть легко адаптирована для фенотипы наблюдается в условиях белок репрессии, при условии целевого выражается с управляемым промоутера.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2