Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Summary

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau in

Abstract

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau in

Protocol

A. Cultuur van de Cel en Proteïne Inductie

Dit hoofdstuk beschrijft celkweek voorwaarden, cel-cyclus synchronisatie met Nocodazole, gevolgd door inductie van eiwitexpressie van een reguleerbare promotor in gistcellen.

1. De wild-type giststam W303 (leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) is getransformeerd met een hoog kopie (2μ) plasmide DNA dat ons gen van belang (ENTH2) bevat onder de controle van een methionine-repressible promotor (MET25). 2 mM methionine is voldoende om promotor activiteit te onderdrukken, terwijl de media ontbreekt methionine laat maximale expressie. Daarom kan een reeks van methionine concentraties worden gebruikt om het eiwit tot expressie op het gewenste niveau. 1 Transformatie van plasmide DNA in cellen W303 is gedaan met behulp van de LiAc-TE methode volgens de standaard procedures. ²
   Opmerking: Dit experiment moet worden uitgevoerd door het kweken van de cellen 's nachts in de aanwezigheid van 2 mM methionine te eiwitexpressie garanderen dat alleen op de achtergrond niveaus. De volgende ochtend, moet eiwitexpressie worden geïnduceerd door resuspenderen de cellen in de media ontbreekt methionine direct na cel-cyclus synchronisatie (ongeveer 4u). We hebben echter vastgesteld dat de ENTH2-afhankelijke celdeling fenotype wordt veroorzaakt pas na een aanzienlijke concentratie van ENTH2 heeft opgebouwd in de cellen (meestal na 4-6h van proteïne inductie ^3), waardoor het tijdsverloop voor de analyse van alle uitingen van het fenotype zeer lange (minimaal 16 uur). We hebben geconstateerd dat het kweken van de cellen 's nachts in de aanwezigheid van 0,2 mm methionine de morfologische fenotype onderdrukt, maar laat subkritische eiwitconcentratie die snel kan worden verhoogd tot fenotype-inducerende niveaus wanneer overgebracht naar media ontbreekt methionine. Dit maakt een gedetailleerde analyse van ernstige manifestaties van de celdeling defect in een relatief kortere tijd. We vandaar bevelen aan dat de experimentator het methionine concentratie die sub-drempel is voor het fenotype inductie van geval per geval te bepalen.
2. Pick zes kolonies van een plaat met recent getransformeerde cellen en enten in 50 ml selectief medium met 0,2 mm methionine in een gesteriliseerde erlenmeyer met behulp van standaard steriele technieken. Incubeer overnacht bij 30 ° C in met schudden bij 200 rpm. (Voor meer informatie over standaard gistcultuur voorwaarden, zie ref. 4)
3. De volgende ochtend, schatten celdichtheid door het meten van de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm. Overdracht van het equivalent van 20 OD _{600 nm} van cellen in een steriele centrifugebuis en de oogst door het draaien bij 2200 rpm voor 5 min bij kamertemperatuur.
4. Resuspendeer cellen in YPD bij een concentratie van 0,4 OD _{600 nm} / ml en voeg Nocodazole tot een uiteindelijke concentratie van 15μg/ml van uit een voorraad van 1mg/ml in DMSO. Incubeer gedurende 4 uur bij 30 ° C onder schudden bij max. 200 omw.
   Opmerking: Alternatieve methoden, met inbegrip arrestatie arrestatie aan de G0-fase met behulp van alfa-factor of op G1-S-fase met behulp van hydroxycarbamide kunnen worden gebruikt. We hebben ontdekt dat arrestatie op mitose met behulp van Nocodazole is eenvoudig en effectief genoeg voor onze doeleinden.
5. Na 4h, check percentage cellen in mitose gearresteerd door het tellen van het aantal cellen met gelijke grootte knoppen door het bekijken onder de microscoop. Indien de aanhouding is meer dan 90%, ga dan naar de volgende stap. Anders, te onderhouden cellen in Nocodazole totdat het gewenste percentage van de mitotische arrestatie is bereikt.
6. Oogst cellen door centrifugeren bij 2200 rpm voor 5min en wassen met ijskoud water drie keer. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de pellet in selectieve media ontbreekt methionine in een cel dichtheid van ~ 0,5 OD _{600 nm} / ml. Overdracht helft van het volume van de cellen om een ​​nieuwe steriele buis en voeg methionine tot een uiteindelijke concentratie 0,2 mm. Dit zal dienen als een controle voor effecten als gevolg van basale niveaus van eiwitexpressie. Dit is de eerste keer-punt van het experiment (tijd = 0h). Te analyseren cellen elk uur voor 6 uur.

B. Analyse van de Fenotype Development

Opmerking: Alle analyse methoden beschreven hoeven niet gelijktijdig worden uitgevoerd.

Bepaling van het eiwit expressie niveaus door Western blotting

1. Bij elke keer-punt, het meten van de OD _{600 nm} van de cultuur en oogst 2 OD _{600 nm} equivalenten van cellen door centrifugeren bij 2200 rpm gedurende 5 minuten.
2. Resuspendeer de pellet in 1 ml steriel water toe en breng de suspensie naar een 1,5 ml eppendorfbuisje. Herhaal het centrifugeren in een pellet te verkrijgen. Zuig het supernatant.
3. Resuspendeer de pellet in 50μl SDS-PAGE Laemmli sample buffer (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 2% β-mercaptoethanol en 0,006% broomfenolblauw). Voeg 50μl van zuur gewassen glasparels (0,2-0,4 micron diameter) en vortex gedurende 1 minuut.
4. Kook buisjes op een 95 ° C verwarmen block voor 2 minuten, vortex weer voor 30 seconden en kook de oplossing opnieuw gedurende 5 minuten. Freeze het eiwit monster bij -20 ° C.
5. Run eiwit monsters op een 12% SDS-PAGE gel, overbrengen op een nitrocellulose membraan en uit te voeren Western blotting met de juiste antilichamen tegen het eiwit van belang op te sporen. In dit voorbeeld hebben we probe de aanwezigheid van hemagglutinine (HA) tagged Enth domeinen door incubatie met muis anti-HA antilichamen (Covance, Princeton, NJ) op 1:2000 verdunning in dronken-Tween (1XPBS, 5% niet-vette droge melk , 0,1% Tween). HRP gelabelde geit anti-muis secundair antilichaam (Pierce) bij een verdunning van 1:2500, ook in dronken-Tween, is toegestaan ​​om de primaire antilichaam bindt op het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Supersignal West Pico chemiluminescent substraat wordt gebruikt om de HRP-gelabeld anti-muis antilichaam te detecteren.
6. Kwantificeren eiwit expressie niveau van densitometrie.

Dit hoofdstuk beschrijft twee methoden voor het bijhouden fenotype ontwikkeling als een functie van toenemende eiwit concentratie. De eerste methode is cel-populatie gebaseerd, terwijl de tweede studies die zij op het niveau van een enkele cel.

Kwantificering van celdeling en celdood fenotype

1. Op elk tijdstip-point, transfer 1 ml celsuspensie met een steriele eppendorfbuisje met steriele technieken en oogsten cellen door centrifugeren bij 2200 rpm gedurende 5 minuten.
2. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 70μl media, gevolgd door 30μl Methyleenblauw uit een voorraad van 1mg/ml in steriel water. Methyleenblauw is een blauwe vitale kleurstof die kleurloos is in het verminderen van omgeving van de cytosol dus dode cellen kunnen worden herkend aan hun blauwe kleur.
3. Pipet ~ 6μl van deze opschorting op een schoon glasplaatje en plaats een dekglaasje op de druppel. Druk de dekglaasje om een ​​dunne, gelijkmatige laag cellen tussen de glas-interfaces te vormen.
4. Verdeel het dekglaasje in 9 kwadranten en neem 3 beelden per kwadrant zoals aangegeven in Fig. 2. Het aantal cellen / veld moet niet groter zijn dan 30 cellen om accurate kwantificering mogelijk te maken. Elke dekglaasje kan worden afgebeeld voor ongeveer 15 minuten voor luchtbellen schade aan de voorbereiding.
5. Tel het aantal cellen met het fenotype onder studie. De celdeling defect veroorzaakte op ENTH2 overexpressie leidt tot celdood en dus hebben we ook tellen van het aantal dode cellen te herkennen aan hun blauwe kleur.
6. Bereken het percentage van fenotypische cellen.
7. Plot de gegevens zoals getoond in Fig. 3.

Visualisatie van fenotype-specifieke afwijkingen met behulp van fluorescentie microscopie

Celdeling defecte cellen, zoals te zien op ENTH2 overexpressie, worden vaak gekenmerkt door celwand gebreken en septin mislocalization3 (gevisualiseerd als GFP-fusie-eiwitten). De celwand van de gist kan eenvoudig worden gevisualiseerd door kleuring met Calcofluor White (CFW), die onomkeerbaar bindt aan chitine in gist celwanden.

1. Bij elke keer-punt, aliquot 1 ml van de cultuur in een steriele eppendorfbuisje en oogsten cellen door centrifugeren bij 2200 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Resuspendeer de cel pellet in 100μl van 1mg/ml CFW oplossing in steriel water en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
3. Oogst cellen door centrifugeren en was 3 keer met 1X PBS.
4. Resuspendeer de pellet in 100μl 1X PBS en het imago onder de loep met behulp van UV-optiek (celwand) en FITC filter (GFP-septin) op 100X vergroting.
5. Kwantificeren percentage cellen met een celwand defect en septin mislocalization door het volgen van de stappen 4-6 in paragraaf B.2.1

B.3. Bepaling van de fenotype ontwikkeling op de enkele cel niveau: Time-lapse video microscopie.

1. Schoon een glasplaatje met een concave depressie met 70% alcohol en aan de lucht laten drogen.
2. Kook 0.06g agarose in 5 ml selectief medium ontbreekt methionine in een steriele glazen buis in een magnetron totdat de agarose volledig opgelost is.
3. Snel pipet 200μl van de agar bevattende media in de dia depressie en omgekeerd een ander schoon glas glijden, zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder zitten.
4. Wanneer de gel stolt, zet u op de top soepel weg van de depressie schuiven, houden van hun oppervlak parallel te allen tijde. Dit zorgt ervoor dat het oppervlak van de agar bed is gelijk met het oppervlak van de depressie dia. Reinig de schuif regio rond de agarose bed met een delicate weefsel. De dia is nu klaar voor gebruik.
5. Op tijd = 4 uur, 1 ml overdracht van cellen van de cultuur tot een steriele eppendorfbuisje en oogsten door centrifugeren bij 2200 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Het is aan te bevelen een later tijdstip-punt gekozen worden om hoge niveaus van eiwitexpressie te verzekeren, zodat fenotype ontwikkeling is gegarandeerd. Pilot experimenten zijn nodig om vaststele inductie keren op een case-by-case basis.
6. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in 100μl van verse selectieve media ontbreekt methionine.
7. Van toepassing vaseline aan de randen van het dekglaasje. Plaats dan een druppel celsuspensie in het midden van de agarose bed en verdeel het gelijkmatig door zachtjes te drukken op een dekglaasje aan over hen.
8. Sluit de randen van het dekglaasje met vaseline en zet haar positie door langs de randen met nagellak. Wacht tot de nagellak droogt.
9. Zet de schuif op een verwarmde fase van een microscoop en kies een veld dat niet meer dan 10 cellen voldoende worden gespreid bevat. Als cellen delen, wordt het veld druk zijn in de tijd.
10. Neem een ​​afbeelding van het veld om de 5 minuten voor ~ 5 uur. Fenotype progressie kan worden bestudeerd door de montage van de beelden in een film met ImageJ software ( Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2.005 )

Opmerking: Wij gebruiken Zeiss Axiovert 200M microscoop, Zeiss Axiocam MRM monochrome digitale camera en Carl Zeiss AxioVision beeldacquisitie software (versie 4.4) voor de live cell imaging. Temperatuur wordt bereikt door het plaatsen van dia's op een verwarmde podium gehandhaafd op 30 ° C door de Pecon Tempcontrol 37-apparaat.

Om te voorkomen dat de focus steeds bijstellen, is het handig om het beeld acquisitie software-programma om automatisch een enkele z-stack beelden te verwerven op elk moment-point en het beeld kiezen met de beste focus later bij de montage van de film. Sommige beeldacquisitie software hebben de mogelijkheid om autofocus voor het tijdsverloop experimenten. Het is handig om die optie te gebruiken in indien beschikbaar.

Wild-type gistcellen groeien het best bij 30 ° C dus temperatuurregeling is van cruciaal belang. Om te zorgen voor adequate hitte, is het nuttig om een externe bron van warmte te bieden in aanvulling op de verwarmde podium. Bijvoorbeeld, laten we het uitgezonden witte licht van de microscoop op voor de gehele duur van de beeldvorming.

Het is ook van cruciaal belang voor luchtbellen te vermijden bij de voorbereiding van de agarose bed en cel sandwich. De lucht ingesloten in de bellen uitzet bij verhitting in de tijd en de neiging om weg te duwen cellen van het veld in beeld wordt gebracht.

Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat individuele cellen posities binnen het veld niet merkbaar veranderen over de duur van het beeldvormingsproces, vooral tijdens heroriëntatie pogingen. Beeldstabilisatie plugins zijn beschikbaar voor ImageJ tot kleine verschuivingen in de cel positie te corrigeren nadat de film is gemonteerd. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / code / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe het toezicht op de ontwikkeling van een morfologische fenotype (gistcel niet in staat om een ​​goede celdeling ondergaan) op eiwit overexpressie. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om gistcellen oogst pelletering bij de aanbevolen centrifugeersnelheid als hogere snelheden kunnen beschadigen cellen en obscure resultaten. Methyleenblauw en Calcofluor wit moet worden toegevoegd aan cellen leven vlak voor beeldvorming zoals ze zijn giftig. Deze procedure kan ook gemakkelijk worden aangepast voor fenotypen waargenomen onder eiwit repressie omstandigheden, op voorwaarde dat het doel wordt uitgedrukt door een beheersbare promotor.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2