नवोदित खमीर में प्रोटीन कांसंट्रेशन की एक फंक्शन के रूप एक morphological Phenotype के विकास विश्लेषण

Summary

जीन विलोपन और प्रोटीन overexpression प्रोटीन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए सामान्य तरीके हैं. इस अनुच्छेद में, हम phenotype के विकास के प्रोटीन एकाग्रता की जनसंख्या पर एक समारोह में एकल कोशिका स्तर के रूप में विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन

Abstract

जीन विलोपन और प्रोटीन overexpression प्रोटीन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए सामान्य तरीके हैं. इस अनुच्छेद में, हम phenotype के विकास के प्रोटीन एकाग्रता की जनसंख्या पर एक समारोह में एकल कोशिका स्तर के रूप में विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन

Protocol

ए सेल संस्कृति और प्रोटीन प्रेरण

इस अनुभाग में सेल संस्कृति शर्तों, Nocodazole साथ तुल्यकालन सेल चक्र, खमीर कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक regulatable प्रमोटर से प्रेरण द्वारा पीछा वर्णन करता है.

1. जंगली प्रकार खमीर तनाव W303 (leu2 3, 112 trp1-1 can1-100 ura3 1 ade2-1 his3 11-15) उच्च (2μ) प्रतिलिपि प्लास्मिड डीएनए कि नियंत्रण के तहत ब्याज की हमारे जीन (ENTH2) शामिल हैं के साथ बदल रहा है प्रमोटर methionine repressible (MET25). Methionine 2mm प्रमोटर गतिविधि को दबाने के लिए पर्याप्त है, जबकि मीडिया methionine कमी अधिकतम अभिव्यक्ति की अनुमति देता है. इसलिए, methionine सांद्रता का एक सीमा के वांछित स्तर पर प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. W303 कोशिकाओं में 1 प्लास्मिड डीएनए के परिवर्तन LiAc - ते विधि का उपयोग कर मानक प्रक्रियाओं के अनुसार किया ^जाता है 2.
   नोट: इस प्रयोग कोशिकाओं पृष्ठभूमि स्तर पर केवल प्रोटीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए methionine 2mm की उपस्थिति में रातोंरात बढ़ रही द्वारा किया जाना चाहिए. अगली सुबह, प्रोटीन अभिव्यक्ति methionine तुरंत निम्नलिखित सेल चक्र तुल्यकालन (लगभग 4) की कमी मीडिया में resuspending कोशिकाओं द्वारा प्रेरित किया जाना चाहिए . हालांकि, हमने पाया है कि सेल ENTH2 निर्भर विभाजन phenotype के बाद ही प्रेरित है ENTH2 के एक काफी एकाग्रता कोशिकाओं में बनाया गया है (आमतौर पर प्रोटीन प्रेरण ³ के 4 - 6 के बाद), के सभी रूपों के विश्लेषण के लिए समय बेशक बनाने बहुत लंबा phenotype (कम से कम 16h). हमने पाया है कि कोशिकाओं की उपस्थिति 0.2mm methionine में रातोंरात बढ़ रही रूपात्मक phenotype represses लेकिन subcritical प्रोटीन एकाग्रता है कि तेजी से phenotype उत्प्रेरण के स्तर बढ़ाया जा सकता है जब मीडिया methionine कमी को हस्तांतरित की अनुमति देता है. यह समय की एक अपेक्षाकृत छोटी अवधि में कोशिका विभाजन दोष के गंभीर अभिव्यक्तियाँ के विस्तृत विश्लेषण परमिट. इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि experimenter methionine एकाग्रता है कि मामले के आधार द्वारा एक मामले पर phenotype शामिल होने के लिए उप दहलीज है निर्धारित है.
2. एक निष्फल शंक्वाकार मानक बाँझ तकनीक का उपयोग कर फ्लास्क में methionine 0.2mm के साथ चयनात्मक मीडिया के 50 मिलीलीटर में हाल ही में बदल कोशिकाओं और टीका लगाना युक्त थाली से छह कालोनियों उठाओ. 30 में रात सेते ° 200 rpm पर झटकों के साथ सी (मानक खमीर संस्कृति शर्तों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, रेफरी देखने के 4. )
3. अगली सुबह 600nm पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा अनुमान सेल घनत्व. 20 आयुध डिपो कक्षों की _600nm एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब और फसल में कमरे के तापमान पर 5min के लिए 2200 rpm पर कताई द्वारा बराबर स्थानांतरण.
4. Resuspend कोशिकाओं में 0.4 आयुध _डिपो 600nm / एमएल के एक एकाग्रता में YPD और 15μg/ml के अंतिम की एकाग्रता DMSO में 1mg/ml के एक शेयर से Nocodazole जोड़ने . 4 के लिए 30 ° C पर 200rpm में मिलाते साथ सेते हैं.
   नोट: G0 चरण का उपयोग कर अल्फा कारक या hydroxyurea का उपयोग G1-S चरण में गिरफ्तारी सहित वैकल्पिक गिरफ्तारी तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने पाया है कि पिंजरे का बँटवारा में गिरफ्तारी Nocodazole का उपयोग सरल और हमारे प्रयोजनों के लिए काफी प्रभावी है.
5. 4 के बाद, खुर्दबीन के नीचे देखने के बराबर आकार की कलियों के साथ कोशिकाओं की संख्या गिनती से पिंजरे का बँटवारा में गिरफ्तार कोशिकाओं के प्रतिशत की जाँच करें. यदि गिरफ्तारी से अधिक 90% है, तो निम्नलिखित कदम के लिए आगे बढ़ना. अन्यथा, Nocodazole में कोशिकाओं को बनाए रखने mitotic गिरफ्तारी के वांछित प्रतिशत तक हासिल की है.
6. 5min के लिए 2200 rpm और बर्फ के ठंडे पानी के साथ तीन बार धोने पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं. अंतिम धोने के बाद, ~ 0.5 आयुध डिपो _600nm / एमएल के एक सेल घनत्व में चयनात्मक methionine कमी मीडिया में गोली resuspend. एक नया बाँझ ट्यूब कक्षों की आधी मात्रा स्थानांतरण और अंतिम 0.2mm एकाग्रता के लिए methionine जोड़ने. यह प्रोटीन अभिव्यक्ति की बेसल स्तर के कारण प्रभाव के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे. इस प्रयोग (समय = 0h) के समय बिंदु पहले निशान. कोशिकाओं 6 के लिए हर घंटे का विश्लेषण करें.

Phenotype विकास बी विश्लेषण

नोट: सभी विश्लेषण को नीचे वर्णित विधियों को एक साथ प्रदर्शन किया जा की जरूरत नहीं है .

प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारण

1. हर समय बिंदु पर, 5 मिनट के लिए 2200 rpm पर centrifugation द्वारा संस्कृति और फसल कोशिकाओं के 2 आयुध डिपो _600nm समकक्ष के आयुध डिपो _600nm को मापने.
2. 1ml बाँझ पानी में गोली Resuspend और एक 1.5ml Eppendorf ट्यूब करने के लिए निलंबन हस्तांतरण. Centrifugation दोहराएँ एक गोली प्राप्त. सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
3. 50μl एसडीएस PAGE laemmli नमूना बफर (50mm Tris पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 2% β-mercaptoethanol और 0.006% bromophenol नीले) में गोली Resuspend. एसिड धोया ग्लास (0.2-0.4 माइक्रोन व्यास) माला और 1 मिनट के लिए भंवर के 50μl जोड़ें.
4. एक 95 ° सी गर्मी blo पर फोड़ा ट्यूबों2 मिनट के लिए सी.के., 30 सेकेंड के लिए फिर से भंवर और 5 मिनट के लिए उबलते फिर से शुरू. -20 डिग्री सेल्सियस में प्रोटीन नमूना रुक
5. Nitrocellulose झिल्ली पर एक 12% जेल एसडीएस PAGE, हस्तांतरण पर प्रोटीन के नमूने और भागो उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करने के लिए ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने. इस उदाहरण में, हम haemagglutinin (हेक्टेयर) मदहोश - बीच में 1:2000 कमजोर पड़ने (1XPBS, 5% गैर वसा शुष्क दूध पर माउस विरोधी हा एंटीबॉडी (Covance, प्रिंसटन, न्यू जर्सी) के साथ incubating द्वारा ENTH डोमेन टैग की उपस्थिति की जांच , 0.1% बीच). एचआरपी 1:2500 की एक कमजोर पड़ने पर विरोधी माउस बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी (पियर्स) टैग भी मदहोश के बीच में, 1 के लिए कमरे के तापमान पर झिल्ली पर प्राथमिक एंटीबॉडी बाँध की अनुमति दी है. Supersignal पश्चिम पिको chemiluminescent सब्सट्रेट एचआरपी टैग विरोधी माउस एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
6. Densitometry द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर यों.

इस अनुभाग में प्रोटीन एकाग्रता बढ़ाने के एक समारोह के रूप में ट्रैकिंग phenotype के विकास की दो विधियों का वर्णन है. पहली विधि सेल जनसंख्या आधारित है, जबकि दूसरा अध्ययन यह एक एकल कोशिका के स्तर पर.

सेल विभाजन phenotype और कोशिका मृत्यु की मात्रा का ठहराव

1. प्रत्येक समय बिंदु पर, एक बाँझ Eppendorf 5 मिनट के लिए 2200 rpm पर centrifugation द्वारा बाँझ तकनीक और फसल की कोशिकाओं का उपयोग कर ट्यूब 1ml सेल निलंबन हस्तांतरण.
2. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 70μl मीडिया में गोली, बाँझ पानी में 1mg/ml के एक शेयर से 30μl Methylene नीले के द्वारा पीछा किया resuspend. Methylene नीले एक नीले महत्वपूर्ण डाई है कि इसलिए मृत कोशिकाओं उनके नीले रंग से पहचाना जा सकता है है cytosol के वातावरण को कम करने में बेरंग हो जाता है.
3. एक साफ कांच स्लाइड पर इस निलंबन की पिपेट ~ 6μl और ड्रॉप पर एक coverslip जगह है. Coverslip धीरे प्रेस एक पतली, कांच इंटरफेस के बीच कोशिकाओं के एक समान परत फार्म.
4. 9 quadrants में coverslip फूट डालो और वृत्त का चतुर्थ भाग प्रति 3 चित्र लेने के रूप में छवि में संकेत दिया. 2. कोशिकाओं / क्षेत्र की संख्या 30 से सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति कोशिकाओं की तुलना में बड़ा नहीं होना चाहिए. लगभग 15 मिनट के लिए प्रत्येक coverslip imaged किया जा सकता से पहले हवाई बुलबुले तैयारी नुकसान.
5. अध्ययन के तहत phenotype दिखा कोशिकाओं की संख्या गिनो. कोशिका विभाजन ENTH2 overexpression पर प्रेरित दोष कोशिका मृत्यु की ओर जाता है है और इसलिए, हम भी उनके नीले रंग से पहचान मृत कोशिकाओं की संख्या गिनती.
6. प्ररूपी कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना.
7. प्लॉट के रूप में छवि में दिखाया गया डेटा. 3.

Phenotype विशिष्ट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग दोषों के दृश्य

सेल विभाजन दोषपूर्ण कोशिकाओं, के रूप में ENTH2 overexpression पर देखा है, अक्सर कोशिका दीवार दोषों और septin mislocalization3 (GFP संलयन प्रोटीन के रूप में कल्पना) द्वारा विशेषता है. नवोदित खमीर की कोशिका दीवार को आसानी से Calcofluor (CfW) व्हाइट जो अचल बांध खमीर कोशिका दीवारों में chitin के साथ धुंधला हो जाना द्वारा visualized किया जा सकता है.

1. हर बार इंगित करें, संस्कृति का एक बाँझ Eppendorf और 2200 rpm पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा ट्यूब फसल कोशिकाओं में विभाज्य 1ml.
2. 100μl बाँझ पानी और सेते में 1mg/ml CfW समाधान में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अंधेरे में सेल गोली Resuspend.
3. Centrifugation और 1X पीबीएस के साथ 3 बार धोने से हार्वेस्ट कोशिकाओं.
4. Resuspend 100X बढ़ाई 100μl 1X पीबीएस में गोली और यूवी प्रकाशिकी का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे छवि (कोशिका दीवार) FITC और फिल्टर (GFP septin).
5. यों B.2.1 अनुभाग में निम्न 4-6 कदम के द्वारा कोशिका दीवार दोष और septin mislocalization के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत

B.3. Phenotype के विकास की एकल कोशिका के स्तर पर निर्धारण: समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी.

1. 70% शराब के साथ एक अवतल अवसाद के साथ एक गिलास स्लाइड को साफ और शुष्क हवा की अनुमति.
2. 5ml एक बाँझ ग्लास ट्यूब में चयनात्मक methionine एक माइक्रोवेव में जब तक agarose पूरी तरह घुल कमी मीडिया में 0.06g agarose उबाल लें.
3. जल्दी agarose के विंदुक 200μl स्लाइड अवसाद में मीडिया को शामिल करने वाले और इसे पर एक और स्वच्छ गिलास स्लाइड पलटना, सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले के नीचे फंस रहे हैं.
4. जब जेल solidifies, शीर्ष पर स्लाइड आसानी से अवसाद स्लाइड से दूर ले जाने, उनके सतहों सभी समय पर समानांतर रखने. यह सुनिश्चित करता है कि agarose बिस्तर की सतह अवसाद स्लाइड की सतह के साथ भरा है. स्लाइड एक नाजुक ऊतकों के साथ agarose बिस्तर आसपास के क्षेत्र को साफ करो. स्लाइड अब इस्तेमाल के लिए तैयार है.
5. समय = 4 घंटे, संस्कृति से एक बाँझ Eppendorf और 2200 rpm पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा ट्यूब फसल के लिए कोशिकाओं के हस्तांतरण 1ml.
   नोट: यह सिफारिश की है एक बाद में समय बात करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को विश्वास दिलाता हूं ताकि phenotype के विकास की गारंटी है चुना जा है. पायलट प्रयोगों determin के लिए आवश्यक हैंमामले के आधार द्वारा एक मामले पर प्रेरण बार ई.
6. ताजा चयनात्मक methionine कमी मीडिया के 100μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं Aspirate.
7. Coverslip के किनारों के लिए पेट्रोलियम जेली लागू करें. फिर agarose बिस्तर के केंद्र में सेल निलंबन की एक बूंद जगह है और धीरे से उन पर एक coverslip दबाकर समान फैल.
8. पेट्रोलियम जेली के साथ coverslip के किनारों को सील करने और नेल पॉलिश के साथ किनारों को अस्तर द्वारा अपनी स्थिति को ठीक. नेल पॉलिश dries जब तक रुको.
9. एक खुर्दबीन के एक गर्म मंच पर स्लाइड प्लेस और एक क्षेत्र है कि कोई 10 से अधिक पर्याप्त रूप से दूरी कोशिकाओं शामिल चुनें. जैसा कि कोशिकाओं के विभाजन, फ़ील्ड समय पर भीड़ मिल जाएगा.
10. क्षेत्र ~ 5 घंटे के लिए हर 5 मिनट की एक छवि ले लो. Phenotype प्रगति एक ImageJ सॉफ्टवेयर (का उपयोग फिल्म में छवियों कोडांतरण द्वारा अध्ययन किया जा सकता है Rasband, किया गया था, ImageJ, स्वास्थ्य, बेथेस्डा, मैरीलैंड, संयुक्त राज्य अमेरिका, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों -2005 )

नोट: हम Zeiss Axiovert 200M माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, Zeiss AxioCam MRM डिजिटल कैमरा और कार्ल Zeiss जीना सेल इमेजिंग के लिए AxioVision छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (4.4 संस्करण) मोनोक्रोम . तापमान नियंत्रण PeCon Tempcontrol 37 डिवाइस के द्वारा एक गर्म 30 डिग्री सेल्सियस पर रखा मंच पर स्लाइड्स रखकर हासिल की है .

आदेश में से बचने के लिए ध्यान केंद्रित बार बार पुनः समायोजन, यह छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम स्वचालित रूप से हर समय बिंदु पर कुछ z ढेर छवियों के अधिग्रहण छवि और सबसे अच्छा ध्यान देने के साथ बाद में जब फिल्म कोडांतरण चुन करने के लिए सुविधाजनक है. कुछ छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर समय बेशक प्रयोगों के लिए autofocus का विकल्प है. यह उपलब्ध है जब कि विकल्प का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है.

जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं को 30 में सबसे अच्छा बढ़ने ° तापमान इसलिए सी नियंत्रण महत्वपूर्ण है. आदेश में पर्याप्त गर्मी को सुनिश्चित करने के लिए, यह गर्म चरण के लिए इसके अलावा में गर्मी के एक बाहरी स्रोत प्रदान करने के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, हम इमेजिंग की पूरी अवधि के लिए पर प्रेषित सफेद रोशनी खुर्दबीन के छोड़ दें .

यह भी हवाई बुलबुले से बचने जब ​​agarose बिस्तर और सेल सैंडविच की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है. बुलबुले के भीतर फँस हवा जब समय पर गर्म फैलता है और कोशिकाओं क्षेत्र imaged किया जा रहा से दूर धक्का देते हैं .

यह भी महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र के भीतर व्यक्तिगत सेल पदों सुनिश्चित appreciably इमेजिंग प्रक्रिया की अवधि से अधिक नहीं बदल सकता हूँ फिर से ध्यान केंद्रित करने का प्रयास के दौरान विशेष रूप से . छवि स्थिरीकरण plugins के लिए ImageJ सेल की स्थिति में छोटे बदलाव को सुधारने के बाद फिल्म इकट्ठे गया है उपलब्ध हैं . ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / कोड / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्रोटीन overexpression पर एक morphological phenotype (खमीर उचित कोशिका विभाजन से गुजरना करने में असमर्थ सेल) के विकास पर नजर रखने के लिए. जब इस प्रक्रिया कर रही यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सिफारिश centrifugation गति पर pelleting तेज गति के रूप में कोशिकाओं और अस्पष्ट परिणाम को नुकसान हो सकता है खमीर कोशिकाओं फसल याद है. Methylene नीले और Calcofluor सफेद करने के लिए कोशिकाओं बस इमेजिंग के लिए पहले से जीने के रूप में वे विषाक्त कर रहे हैं जोड़ा जाना चाहिए. यह प्रक्रिया भी आसानी से प्रोटीन दमन शर्तों के तहत मनाया phenotypes के लिए कर सकते हैं अनुकूलित लक्ष्य एक नियंत्रणीय प्रमोटर से व्यक्त किया है प्रदान की हो.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2