Summary
In deze video, beschrijven we een procedure voor de expressie van bacteriële type III effectoren in gist en het identificeren van effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes. Dergelijke fenotypes kan vervolgens worden benut om effectorfuncties en doelstellingen toe te lichten.
Abstract
Vele Gram-negatieve pathogene bacteriën gebruiken een type III secretie systeem om een suite van effector eiwitten verplaatsen in het cytosol van gastheercellen. In de cel, type III effectoren ondermijnen gastheer cellulaire processen om immuunreacties te onderdrukken en pathogeen groei te bevorderen. Tal van type III effectoren van plantaardige en dierlijke bacteriële ziekteverwekkers zijn geïdentificeerd tot op heden, nog slechts een paar van hen zijn goed gekarakteriseerd. Inzicht in de functies van deze effectoren is ondermijnd door een combinatie van functionele redundantie in de effector repertoire van een bepaalde bacteriestam, de subtiele effecten die zij kunnen uitoefenen om virulentie, rollen die zijn mogelijk voor bepaalde infecties stadia, en moeilijkheden bij het genetisch te verhogen het manipuleren van bepaalde ziekteverwekkers. Expressie van type III effectoren in de gist
Protocol
I. Het ontwerpen van een gist Expression Systeem voor Type III Effector
Kalibreren van een gist-systeem geschikt is voor expressie van het type III effector (s) van belang is een belangrijke taak en kan eisen wat trial and error. Factoren die van groot belang dat moet worden overwogen en geoptimaliseerd bij het ontwerpen van een dergelijk systeem zijn: 1) de promotor rijden uitdrukking van de effector (s), 2) het aantal kopieën van de effector-gen, 3) de epitoop-tag gebruikt om de eiwitexpressie te controleren , en 4) van de giststam.
1) Promoter
Omdat bacteriële type III effectoren giftig kunnen zijn voor gistcellen, moet een induceerbare promoter worden gebruikt om hun expressie te controleren. De GAL1 promotor wordt vaak gebruikt voor dit doel en de activiteit wordt gereguleerd door de koolstofbron aanwezig zijn in het groei medium: het is verdrongen door glucose en galactose veroorzaakt door. Dit werd echter promotor gerapporteerd als licht lekkende onder het onderdrukken van omstandigheden die leiden tot ongewenste toxiciteit. Als een soortgelijk probleem wordt aangetroffen, is het raadzaam om het aantal kopieën van de effector-gen te minimaliseren, zoals hieronder beschreven, of om alternatieve induceerbare promoters, zoals de MET3 of CUP1 promotors 1 te gebruiken. Hier beschrijven we de procedures voor het uitdrukken van effector eiwitten uit een galactose-induceerbare promoter.
2) Gene copy-nummer
Een extra parameter die het niveau van eiwitexpressie is het aantal kopieën van het effector-gen aanwezig is in de cel. Hoge expressie niveaus worden bereikt wanneer de effector-gen wordt gedragen door een 2-micron plasmide (40-60 kopieën per cel). Intermediate uitdrukking wordt verkregen door middel van een centromeer-bevattend plasmide (1-3 kopieën per cel), terwijl lage expressie wordt bereikt wanneer de effector-gen is geïntegreerd in het genoom van gist door homologe recombinatie. Door de combinatie van een centromeer-bevattende vector en de GAL1 promotor hebben we met succes geuit over 50 effectoren van de plant pathogenen Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria en Pseudomonas syringae pv. Tomaat op een niveau detecteerbaar door immunoblot analyse en met een verwaarloosbaar lek onder het onderdrukken van omstandigheden (Salomon en Sessa , ongepubliceerd).
3) epitoopmerker
Indien antistoffen tegen de effector van belang zijn niet beschikbaar zijn, is een epitoop-tag gefuseerd met het effector eiwit aan de expressie te controleren door middel van immunoblot. Vaak gebruikte tags zijn Myc, hemagglutinine (HA) of vlag, waarop betrouwbare commerciële antilichamen zijn beschikbaar. We raden u aan slechts een exemplaar van het label om ongewenste schadelijke effecten op de structuur en de activiteit van de effector eiwitten te minimaliseren.
4) giststam
Een fundamentele vereiste voor de giststam om gebruikt te worden voor expressie is auxotrofie aan de selecteerbare merker van de expressievector. Het is belangrijk op te merken dat verschillende giststammen mogelijk verschillende gevoeligheden display om expressie van bepaalde effectoren. We bijvoorbeeld geconstateerd dat de BY4741 en W303 stammen verschillende gevoeligheden voor diverse Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria effectoren (Salomon en Sessa, niet gepubliceerd) zijn. Daarom verdient het de voorkeur om te testen van de effector (s) van belang in de verschillende giststammen.
II. Voorbereiding van de Gist Media
Voor de groei van gist stammen die bevatten geen vector, gebruik YPD (10 g / L gistextract, 20 g / L pepton en 2% [w / v] glucose) als de groei medium. Voor vaste media, voeg 2% [w / v] agar aan de oplossing (als het vaste medium is zeer zacht, 0,05% toe te voegen [v / v] van een 5 N NaOH stockoplossing aan het medium voor de autoclaaf). Wij raden aan de voorbereiding van het medium zonder glucose in 90% van het uiteindelijke volume en autoclaveren het. Kort voor gebruik, vul het volume op 100% met een filter gesteriliseerde 20% [w / v] glucose-oplossing (houd de 20% glucose-oplossing bij 4 ° C om besmetting te voorkomen).
Voor de groei van giststammen met een vector die prototrophy biedt voor een selecteerbare merker (leucine, uracil, histidine of tryptofaan), synthetische drop-out medium te gebruiken zonder leucine, uracil, histidine en tryptofaan (6,7 g / L yeast nitrogen base zonder aminozuren , 1,4 g / L gist synthetische drop-out medium supplement) en met 2% [w / v] glucose, of 2% [w / v] galactose en 1% [w / v] raffinose. Voor vaste media, voeg 2% [w / v] agar aan de oplossing. Wij raden aan de voorbereiding van de medium in 90% van het uiteindelijke volume en autoclaveren het. Kort voor gebruik, vul het volume op 100% met een filter gesteriliseerde 20% glucose-oplossing, of een filter gesteriliseerde 20% galactose + 10% raffinose-oplossing, afhankelijk van de gewenste koolstofbron (houd de 20% glucose en de 20% galactose + 10% raffinose oplossingen bij 4 ° C om besmetting te voorkomen). Afhankelijk van de selecteerbare merker van de uitdrukking VECtor, voeg de andere aminozuren of uracil voor gebruik (10 ml / L van een 1 g/100 ml leucine voorraad, 10 ml / L van een 200 mg/100 ml uracil bouillon, 2 ml / L van een 1 g/100 ml histidine voorraad, of 2 ml / L van een 1 g/100 ml tryptofaan voorraad). Bij de voorbereiding leucine en uracil voorraden, steriliseren ze in autoclaaf en blijf bij kamertemperatuur. Bij de voorbereiding van histidine en tryptofaan voorraden, steriliseren ze door het filteren, wikkel de fles met aluminium folie ter bescherming tegen licht, en houd bij 4 ° C. In de procedures die hieronder worden beschreven, synthetische drop-out medium aangevuld met leucine, is uracil, histidine en tryptofaan aangewezen als synthetisch compleet medium.
Solid-media platen kunnen worden opgeslagen voor maximaal twee maanden bij 4 ° C. Voor gebruik, droog de platen gedurende 20 min in een steriele laminaire stroming kap bij kamertemperatuur.
III. Gist Transformatie
- Voordat u begint met de gist transformatie procedure, de voorbereiding van de volgende drie oplossingen: een 50% [w / v] polyethyleenglycol (PEG) 3350-oplossing, een 1 M LiAc oplossing pH = 8,0, en een TE-oplossing (100 mM Tris pH = 6,85 en 10 mM EDTA pH = 8,0). Filter-steriliseren van de oplossingen en te houden bij 4 ° C.
- Met behulp van een lange houten stok of een steriele inenting lus, kies een gist kolonie (1-2 mm diameter) van een vers bord en enten 3 ml YPD in een 15 ml polypropyleen buis. Vortex kort. Plaats de cultuur buis in een roller en incubeer overnacht bij 30 ° C met een constante rotatie.
- In de ochtend, verwijder de cultuur van de rol en centrifugeer bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren, verwijdert u de supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml resuspensie buffer (10% [v / v] TE-oplossing, 10% [v / v] 1 M LiAc-oplossing) en meng door vortexen.
- Voor elk plasmide te worden getransformeerd en een extra controle transformatie, overdracht 100 ul van de celsuspensie op een microbuisjes.
- Aan elke buis, voeg 5 pl enkele streng zalmsperma DNA (10 mg / ml) en 250-500 ng van het plasmide-DNA te transformeren (behalve voor de controle buis).
- Voeg aan elke buis 650 ul van transformatie-oplossing (10% [v / v] TE-oplossing, 10% [v / v] 1 M LiAc-oplossing, 80% [v / v] van 50% [w / v] PEG-oplossing ) en vortex.
- Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten op een roller.
- Haal de buizen uit de shaker, voeg 70 pl DMSO, en meng door de buizen 10-15 keer (niet vortex om te voorkomen dat het breken van de cellen).
- Plaats de buizen in een 42 ° C voorverwarmde waterbad en incubeer gedurende 15 minuten.
- Haal de buizen uit het waterbad en direct te plaatsen op ijs gedurende 2 minuten.
- Nadat de buizen zijn afgekoeld, centrifuge ze bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Haal de buizen uit de microcentrifuge en verwijder voorzichtig de viskeuze supernatant met behulp van een pipet.
- Resuspendeer de celpellet van elke buis in 150 pi steriel dubbel gedestilleerd water (DDW), en de verspreiding van de celsuspensie op een synthetisch complete medium plaat met 2% glucose als koolstofbron en zonder het aminozuur of nucleotide waarop het plasmide biedt prototrophy.
- Laat de platen open voor 2 min en laat ze drogen in een laminaire stroming kap. Leg de platen in een 30 ° C incubator voor twee-drie dagen.
- Zodra kolonies (1-2 mm diameter) zijn verschenen op de platen, neem ongeveer 10 single kolonies van elke transformatie en overbrengen naar een nieuwe plaat. Bij het overbrengen van de kolonies, maakt 2 cm x 2 cm plekken om de groei van een grote hoeveelheid gistcellen toe te staan. Incubeer de platen in een incubator bij 30 ° C gedurende twee dagen.
- Wanneer de gist patches zijn gegroeid, verwijder de platen uit de incubator en verzegelen met parafilm. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C. Overdracht kolonies om een nieuwe plaat om de 10-14 dagen.
IV. De voorbereiding van een Gist Protein Extract om Effector Expression controleren door middel van immunoblot
- Kies een gist kolonie (1-2 mm diameter) van een vers bord om een 15 ml polypropyleen buisje met 3 ml van de juiste synthetische complete medium aangevuld met 2% glucose als koolstofbron en zonder het aminozuur of nucleotide waarop het plasmide keuze biedt prototrophy. Plaats de cultuur buis in een roller en incubeer overnacht bij 30 ° C.
- In de volgende dagen, verwijder de cultuur van de rol en centrifugeer bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Haal de buizen van de centrifuge en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 3 ml steriele DDW en door vortexen gemengd.
- Centrifugeer opnieuw, gooi supernatant, en resuspendeer cellen in 3 ml steriele DDW.
- Overdracht 200 pi van de celsuspensie om een nieuwe 15 ml buis met 3 ml synthetisch compleet medium aangevuld met 2% galactose en 1% raffinose als een koolstofbron, en zonder het aminozuur of nucleotide waarop de plasmide van de keuze biedt prototrophy.Meng door vortexen, plaats in een rol, en incubeer overnacht bij 30 ° C.
- In de volgende ochtend, breng 1 ml van de cultuur (of meer voor lage dichtheid culturen) om een microbuisjes. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vanaf hier, werken in een zuurkast om te voorkomen dat de ademhaling β-mercapto-ethanol giftige dampen. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een pipet en resuspendeer de cel pellet in 100 ul ijskoude lysis oplossing (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-mercapto-ethanol). Meng krachtig door vortexen en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Tijdens de incubatie, bepaalt het volume van de HCl (6 N) die nodig zijn voor titering 100 ul van lysis buffer om de pH 9-10. Om dit doel wordt 10 microbuisjes in een rek en overdracht 100 ul van de lysis buffer in elk van hen. Voeg verschillende volumes (1-10 ul) van HCl (6 N) aan elke buis en door vortexen gemengd. Neem een monster en controleer de pH van de oplossing met behulp van een pH-indicator strip.
- Aan het eind van de incubatie, voeg de HCl volume bepaald in de vorige stap aan het lysaat en door vortexen gemengd (voor een betere nauwkeurigheid, de HCl-oplossing op de zijkant van de buis, zonder de tip in het lysaat).
- Voeg 50 ul van 3x monsterbuffer (30% [v / v] glycerol, 15% [v / v] β-mercapto-ethanol, 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [w / v ] natriumdodecylsulfaat [SDS] en enkele korrels broomfenolblauw) naar de lysaat en door vortexen gemengd (als de kleur omslaat naar geel, betekent dit dat de pH te laag is, en een paar microliter van lysis oplossing moet toegevoegd tot de oplossing wordt blauw).
- Kook het lysaat oplossing gedurende 5 minuten op een verwarmings-blok na doorprikken een gat in de deksel van de microbuisjes met een naald.
- Haal de microbuisjes uit de verwarmings-blok en laat de oplossing afkoelen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Vortex het lysaat oplossing en vervolgens draai het naar beneden voor 10 sec. Load 30 ul op een SDS-PAGE gel voor immunoblot analyse.
V. Spotting Assay aan Effector-geïnduceerde Groeiremmingsonderzoek fenotypes Detect
- Van een vers bord kies een gist kolonie (1-2 mm diameter) met de expressieplasmide van de belangstelling en enten, in een 15 ml polypropyleen buis, 3 ml van synthetische compleet medium aangevuld met 2% glucose als koolstofbron en zonder het aminozuur zuur of nucleotide waarop de expressie plasmide biedt prototrophy. Herhaal deze procedure voor een controle gist stam die een leeg plasmide. Plaats de cultuur van buizen in een roller en incubeer overnacht bij 30 ° C met een constante rotatie.
- In de volgende dagen, verwijder de culturen van de rol en centrifugeer bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Haal de buizen van de centrifuge en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 3 ml steriele DDW en door vortexen gemengd.
- Herhaal het centrifugeren stap en resuspendeer cellen in 3 ml steriele DDW.
- Voor het bepalen van hun optische dichtheid (OD), overdracht 100 pi van elke cultuur een microbuisjes met 900 ul DDW en vortex. Giet de inhoud van de buizen in een plastic cuvet en meet de absorptie bij een golflengte van 600 nm (te gebruiken als referentie een cuvet gevuld met 1 ml van de DDW). Bereken de OD 600 van de oorspronkelijke culturen door vermenigvuldiging van de OD 600 van de culturen in de cuvette met een verdunningsfactor van 10.
- Vervolgens op basis van de OD 600 van de oorspronkelijke culturen, voor te bereiden celsuspensies (1 ml) met een OD 600 = 1,0 in steriele microbuisjes.
- Door het gebruik van 3 steriele microbuisjes gevuld met 900 ul steriel DDW, bereiden drie 10-voudige seriële verdunningen (OD 600 = 0,1, 0,01 en 0,001) van elke cel suspensie (OD 600 = 1.0), opgesteld in de vorige stap.
- Bereid twee platen met synthetische compleet medium zonder het aminozuur of nucleotide waarop de plasmide van de keuze biedt prototrophy. Het medium van een plaat moeten worden aangevuld met 2% glucose en die van de andere plaat met 2% galactose en 1% raffinose. Droog de platen in een steriele laminaire stroming kap bij kamertemperatuur gedurende 20 min en leg ze op een rooster.
- Voor elke cultuur, spot 10 ul van de vier verdunningen in een rij op zowel het onderdrukken en het induceren van media.
- Na het spotten, laat de platen te openen in de kap enkele minuten. Wanneer de vlekken droog zijn, hebben betrekking op de borden en leg ze in een 30 ° C incubator voor 2-3 dagen.
- Na incubatie, nemen de platen en analyseren gist groei. De eerste, bevestigen dat de cel dichtheden zijn vergelijkbaar op de plaat met het onderdrukken van medium. Vervolgens vergelijken de groei van de cultuur uiting van de effector eiwit van belang met de cultuur die een lege vector op de plaat met inducerend medium.
Opmerking: effectoren kunnen gericht zijn op cellulaire processen die niet zijn snelheidsbeperkende om gist groei onder standaard laboratorium groeiomstandigheden.Om de identificatie van de groeiremming fenotypes voor dergelijke effectoren, kan het induceren van media worden aangevuld met verbindingen die gist cellulaire functies te wijzigen, waardoor hun gevoeligheid voor effectoren. Voor een lijst van chemische stoffen die mogelijk kunnen worden geïntegreerd in deze procedure, raadpleegt u Parsons et al.. (2004) 2.
VI. Representatieve resultaten
Een vertegenwoordiger gist spotten assay en de opsporing van groeiremming fenotypes geïnduceerd door expressie van type III effectoren worden getoond in Fig. 1. In dit experiment werden de type III effectoren AvrPto, HopAA1-1 en AvrE1 van de Gram-negatieve bacterie fytopathogene Pseudomonas syringae pv. Tomaat (PST) tot expressie gebracht van de centromeer-bevattende plasmide pGML10 in de giststam BY4741, en getest op hun vermogen te remmen gist groei. Individuele gistculturen uiten Pst type III effectoren onder de controle van de induceerbare galactose GAL1 promotor of met een lege vector werden serieel verdund en uitgeplaat op repressie (glucose) of inducerende (galactose) media (afb. 1). Op onderdrukken medium, giststammen dragen plasmiden voor de expressie van AvrPto en HopAA1-1 vertoonden dezelfde groei als de controle-stam met een lege vector. Echter op hetzelfde medium, gist dragen AvrE1 toonde een iets lagere groei, waarschijnlijk te maken met een zekere mate van lekkage van de GAL1 promotor en de hoge cytotoxische werking van AvrE1. In het induceren van omstandigheden, uitdrukking van de AvrE1 effector geleid tot een drastische remming van de groei fenotype tot uiting door het ontbreken van kolonies in een eventuele verdunning. Zoals eerder opgemerkt door Munkvold et al.. 3, expressie van HopAA1-1 heeft ook geleid tot ernstige remming van de groei, terwijl AvrPto toonde geen enkel effect.
Figuur 1. Gist remming van de groei veroorzaakt door expressie van de Pseudomonas syringae pv. Tomaat (PST) type III effectoren AvrE1 en HopAA1-1. Giststammen (BY4741) met het plasmide pGML10, leeg of het uitvoeren GAL1 aangedreven cassettes voor galactose-induceerbare expressie van AvrPto , HopAA1-1 of AvrE1, werden gedurende de nacht gekweekt in synthetisch compleet medium aangevuld met glucose (2%) als koolstofbron, en gebrek aan leucine. Culturen werden gewassen, genormaliseerd tot OD 600 = 1.0 en seriële 10-voudige verdunningen werden gespot op synthetische volledige vaste media ontbreekt leucine en met glucose (2%) of galactose (2%) en raffinose (1%). Foto's werden genomen na 2 en 3 dagen van de groei op 30 ° C voor gist groeien in glucose en galactose media, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de gist Saccharomyces cerevisiae te gebruiken als een heterologe systeem voor de expressie van type III bacteriële effector eiwitten en hoe de effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes te identificeren. Belangrijk is, kunnen deze fenotypes worden gebruikt in genetische screens om onderdrukkers van de negatieve impact van effectoren op gist groei te identificeren. Onderdrukkers kunnen vertegenwoordigen hetzij direct doelwit van de effector bestudeerde of eiwitten die deel uitmaken van cellulaire processen beïnvloed door de effector. Tal van type III effectoren van dierlijke en plantaardige bacteriële ziekteverwekkers zijn uitgedrukt in gist-to-date, en groeiremming fenotypes veroorzaakt door verschillende van hen werden gebruikt om processen of paden die zij zich richten 1,4 identificeren. In verschillende studies werd effector toxiciteit in gist ook met succes benut om nieuwe bacteriële effectoren 5 te identificeren. Bovendien kunnen effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes worden benut voor drug discovery in screens van chemische bibliotheken voor verbindingen die de toxiciteit van effectoren in gist 6 te onderdrukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212750 | |
| Peptone | Difco Laboratories | 211677 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco Laboratories | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | >99%; <0.1% glucose |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | R0250 | >98% |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| L-histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | Desiccate |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4958 | |
| Tris (base) | JT Baker | 4109-02 | |
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B6131 | |
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck & Co., Inc. | 8.22050.1000 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt Ltd | 67.742 | |
| Inoculation loop | Sigma-Aldrich | Z643009 | Sterile |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck & Co., Inc. | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
