בסרטון הזה, אנו מתארים הליך הביטוי של effectors סוג החיידק השלישי שמרים זיהוי של מפעיל-Induced פנוטיפים עיכוב צמיחה. פנוטיפים אלו ניתן לנצל לאחר מכן להבהיר פונקציות מפעיל ויעדים.
Abstract
רבים גראם שליליים חיידקים פתוגניים להשתמש במערכת הפרשת סוג השלישי translocate חבילה של חלבונים מפעיל לתוך cytosol של התאים המארחים. בתוך התא, סוג effectors III לחתור לתהליכים מארח הסלולר לדכא תגובות חיסוניות ולקדם צמיחה הפתוגן. רבים סוג effectors השלישי של פתוגנים צמחים ובעלי חיים בקטריאליים זוהו עד כה, אך רק מעטים מהם מאופיינים היטב. הבנת תפקידי effectors אלה כבר ערערו על ידי שילוב של יתירות פונקציונלית ברפרטואר מפעיל של זן חיידקי מסוים, את ההשפעות עדין כי הם עלולים להפעיל להגדיל ארסיות, תפקידים ספציפיים ואולי בשלבים מסוימים זיהום, וקשיים גנטית מניפולציה פתוגנים מסוימים. הביטוי של effectors סוג השלישי השמרים ניצני<em> Saccharomyces cerevisiae</em> עשויה לאפשר עקיפת המגבלות האלה וסיוע אפיון פונקציונלי של חלבונים מפעיל. בגלל סוג effectors III לעתים קרובות יעד תהליכים תאיים כי הם שמורים בין שמרים אאוקריוטים אחרים, הביטוי שלהם שמרים עלול לגרום עיכוב גדילה פנוטיפים כי ניתן לנצל על מנת להבהיר פונקציות מפעיל ויעדים. יתרונות נוספים לשימוש שמרים ללימודי תפקודית של effectors חיידקי כוללים נהילות הגנטי שלהם, מידע על פונקציות החזוי של הרוב המכריע של ORFs שלהם, הזמינות של כלים ומשאבים רבים לניסויים הן הגנום כולו ואת בקנה מידה קטן. כאן אנו דנים גורמים קריטיים לעיצוב מערכת שמרים לביטוי של חלבונים חיידקיים סוג III מפעיל. אלה כוללים את האמרגן המתאים לנהיגה הביטוי של הגן מפעיל (ים) של עניין, מספר עותק של הגן מפעיל, תג epitope להשתמש כדי לאמת את ביטוי חלבון, את המתח שמרים. אנו מציגים נהלים כדי לגרום ביטוי effectors ב שמרים לאמת הביטוי שלהם על ידי immunoblotting. בנוסף, אנו מתארים assay תצפית על צלחות אגר לזיהוי של מפעיל-Induced פנוטיפים עיכוב צמיחה. השימוש בפרוטוקול זה עשוי להתארך כדי לחקור את הגורמים pathogenicity נמסר לתוך התא המארח על ידי פתוגן כל מנגנון טרנסלוקציה.
Protocol
I. עיצוב מערכת הביטוי שמרים עבור effectors סוג III כיול מערכת שמרים מתאים ביטוי III סוג מפעיל (ים) של עניין היא משימה חשובה ועשוי לדרוש קצת ניסוי וטעייה. גורמים הרלוונטיות העיקריות שיש לשקול אופטימיזציה בעת תכנון מערכת כזו הם: 1) מקדם נהיגה ?…
Discussion
במצגת זו, הדגמנו כיצד להשתמש cerevisiae Saccharomyces נבגי שמרים כמערכת Heterologous לביטוי של חלבונים מסוג III מפעיל חיידקים כיצד לזהות מפעיל-Induced עיכוב פנוטיפים צמיחה. חשוב לציין, פנוטיפים אלה יכול להיות מנוצל על מסכי גנטית כדי לזהות מדכאי של ההשפעה השלילית של effectors על צמיחת שמרי…
Salomon, D., Sessa, G. Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast. J. Vis. Exp. (37), e1865, doi:10.3791/1865 (2010).