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Biology

खमीर में बैक्टीरियल प्रकार III effectors की अभिव्यक्ति से प्रेरित विकास निषेध phenotypes की पहचान

doi: 10.3791/1865 Published: March 30, 2010

Summary

इस वीडियो में, हम खमीर और effector प्रेरित विकास निषेध phenotypes की पहचान में बैक्टीरिया प्रकार III effectors की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. ऐसे phenotypes बाद effector कार्यों और लक्ष्यों को स्पष्ट करने के लिए शोषण कर सकते हैं.

Protocol

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I. प्रकार III effectors के लिए एक खमीर अभिव्यक्ति सिस्टम डिजाइनिंग

एक खमीर प्रकार effector III (ओं) के ब्याज की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त प्रणाली calibrating एक महत्वपूर्ण कार्य है और कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है. प्रासंगिकता के प्रमुख कारक है कि विचार किया जाना चाहिए और अनुकूलित जब एक ऐसी प्रणाली डिजाइन कर रहे हैं: 1) प्रमोटर) की अभिव्यक्ति effector (ओं) 2, ड्राइविंग effector जीन, 3 की प्रतिलिपि संख्या) मिलान प्रोटीन अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया टैग , और 4) खमीर तनाव.

1) प्रोमोटर

क्योंकि बैक्टीरियल प्रकार III effectors खमीर कोशिकाओं को विषाक्त किया जा सकता है, एक inducible प्रमोटर अपनी अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. GAL1 प्रमोटर आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए प्रयोग किया जाता है और अपनी गतिविधि मध्यम विकास में मौजूद कार्बन स्रोत के द्वारा नियंत्रित किया जाता है: यह ग्लूकोज द्वारा दमित है और galactose से प्रेरित है. हालांकि, इस प्रमोटर के रूप में थोड़ा टपकाया दमन अवांछित विषाक्तता में जिसके परिणामस्वरूप शर्तों के तहत सूचना मिली थी. यदि एक ऐसी ही समस्या का सामना करना पड़ा है, यह सलाह दी जाती है effector जीन की नकल संख्या कम से कम के रूप में नीचे वर्णित है, या MET3 या CUP1 1 प्रमोटरों के रूप में वैकल्पिक inducible प्रमोटरों, का उपयोग. यहाँ हम galactose-inducible प्रमोटर से effector प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन.

2) जीन कॉपी संख्या

एक अतिरिक्त पैरामीटर प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित effector कोशिका में मौजूद जीन की प्रतियों की संख्या है. उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त कर रहे हैं जब effector जीन द्वारा किया जाता है एक प्लाज्मिड 2 माइक्रोन (40-60 प्रतियां सेल प्रति). मध्यवर्ती अभिव्यक्ति centromere युक्त प्लाज्मिड (सेल प्रति 1-3 प्रतियां) का उपयोग करते हुए, जबकि कम अभिव्यक्ति जब effector जीन मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा खमीर जीनोम में एकीकृत है हासिल की है के द्वारा प्राप्त की है. एक centromere युक्त वेक्टर और GAL1 प्रमोटर के संयोजन से हम सफलतापूर्वक संयंत्र रोगज़नक़ों Xanthomonas campestris pv vesicatoria. Pseudomonas और syringae pv के बारे में 50 effectors व्यक्त की है. Immunoblot विश्लेषण द्वारा detectable स्तर पर और दमन शर्तों के तहत नगण्य रिसाव (सॉलोमन और Sessa के साथ टमाटर , अप्रकाशित).

3) का मिलान टैग

यदि ब्याज की effector के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, एक मिलान टैग effector प्रोटीन से जुड़े हुए है immunoblot द्वारा अपनी अभिव्यक्ति की निगरानी. आमतौर पर इस्तेमाल किया टैग Myc, hemagglutinin (हेक्टेयर) या ध्वज कर रहे हैं, जो विश्वसनीय वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं. हम टैग का केवल एक प्रतिलिपि का उपयोग करने के लिए effector प्रोटीन की संरचना और गतिविधि पर अवांछित हानिकारक प्रभाव को कम सुझाव देते हैं.

4) खमीर तनाव

खमीर तनाव के लिए एक मौलिक आवश्यकता करने के लिए अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा अभिव्यक्ति वेक्टर के चयन मार्कर auxotrophy है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि अलग खमीर उपभेदों अलग संवेदनशीलता कुछ effectors की अभिव्यक्ति को प्रदर्शित कर सकता है है. उदाहरण के लिए, हम ने कहा कि BY4741 और W303 उपभेदों कई Xanthomonas campestris pv vesicatoria effectors (सॉलोमन और Sessa, अप्रकाशित) के लिए अलग संवेदनशीलता है . इसलिए, यह बेहतर है अलग खमीर उपभेदों में ब्याज की effector (ओं) का परीक्षण.

द्वितीय. खमीर मीडिया की तैयारी

खमीर उपभेदों है कि किसी भी सदिश शामिल नहीं है, विकास के माध्यम के रूप में YPD (10 छ / एल खमीर निकालने, 20 छ / एल peptone और 2% [w / ध्] ग्लूकोज) का उपयोग के विकास के लिए. ठोस मीडिया के लिए, 2% समाधान (अगर ठोस मध्यम बहुत नरम है, [v / v] एक 5 एन NaOH शेयर समाधान से autoclaving पहले मध्यम 0.05% जोड़ने) [w / ध्] अगर जोड़ने. हम मध्यम ग्लूकोज बिना तैयारी अनुशंसा करते हैं अंतिम मात्रा का 90% में और यह autoclaving. शीघ्र ही का उपयोग करने से पहले, एक फिल्टर निष्फल 20% [w / ध्] ग्लूकोज समाधान (20% 4 पर ग्लूकोज समाधान रखने संदूषण रोकने के लिए डिग्री सेल्सियस) के साथ 100% मात्रा को भरने.

खमीर उपभेदों से युक्त एक सदिश है कि एक चयन मार्कर prototrophy प्रदान करता है (leucine, uracil हिस्टडीन, या tryptophan) के विकास के लिए, leucine बिना सिंथेटिक मध्यम ड्रॉप - आउट का उपयोग करें, uracil हिस्टडीन, और tryptophan (6.7 अमीनो एसिड के बिना खमीर छ / एल नाइट्रोजन बेस , 1.4 छ / एल खमीर सिंथेटिक मध्यम पूरक बाहर ड्रॉप) और 2% [w / ध्] ग्लूकोज, या 2% [w / ध्] galactose और 1% [w v /] raffinose युक्त. मीडिया के लिए ठोस समाधान के लिए 2% [w / ध्] अगर जोड़ने. हम अंतिम मात्रा का 90% में मध्यम तैयारी की सिफारिश और यह autoclaving. शीघ्र ही का उपयोग करने से पहले, एक फिल्टर निष्फल 20% ग्लूकोज समाधान है, या एक फिल्टर निष्फल 20% galactose + 10% raffinose समाधान वांछित कार्बन स्रोत (20% ग्लूकोज और 20% रखने पर निर्भर करता है के साथ 100% मात्रा को भरने + 4 में 10% raffinose समाधान galactose डिग्री सेल्सियस संदूषण रोकने के लिए). अभिव्यक्ति vec का चयन मार्कर पर निर्भर करता हैटो, उपयोग करने से पहले (10 मिलीलीटर / 1 g/100 मिलीलीटर leucine स्टॉक से एल / 10 एक 200 mg/100 मिलीलीटर uracil शेयर से मिलीलीटर एल, 2 1 g/100 मिलीग्राम / एल से अन्य अमीनो एसिड या uracil जोड़ने मिलीलीटर हिस्टडीन स्टॉक या 2 मिलीलीटर / एल 1 g/100 मिलीलीटर tryptophan स्टॉक से). जब leucine और uracil शेयरों की तैयारी है, उन्हें autoclaving द्वारा बाँझ और कमरे के तापमान पर रहते हैं. जब हिस्टडीन और tryptophan के शेयरों की तैयारी है, उन्हें छान कर बाँझ, एल्यूमीनियम पन्नी प्रकाश से बचाने के साथ बोतल लपेटो, और 4 बजे रखने डिग्री सेल्सियस प्रक्रियाओं में नीचे वर्णित है, सिंथेटिक ड्रॉप - आउट leucine के साथ पूरक मध्यम, uracil हिस्टडीन, और tryptophan सिंथेटिक पूरा माध्यम के रूप में नामित है.

ठोस मीडिया प्लेटों के लिए भंडारित किया जा सकता है दो महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में प्लेटें सूखी.

III. खमीर परिवर्तन

  1. खमीर परिवर्तन की प्रक्रिया शुरू करने से पहले, निम्नलिखित तीन समाधान तैयार: एक 50% [w / ध्] polyethylene glycol (खूंटी) 3350 समाधान, एक 1 एम LiAc समाधान 8.0 = पीएच, और एक ते (100 मिमी Tris = पीएच 6.85 और समाधान 10 मिमी EDTA = पीएच 8.0). समाधान फ़िल्टर बाँझ और 4 बजे रखने डिग्री सेल्सियस
  2. एक लम्बी लकड़ी शाफ्ट या एक बाँझ टीका पाश का उपयोग करना, एक ताजा थाली से एक खमीर कॉलोनी (1-2 मिमी व्यास) लेने और एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में YPD के 3 मिलीलीटर टीका लगाना. भंवर संक्षिप्त. एक रोलर में संस्कृति ट्यूब प्लेस में 30 डिग्री सेल्सियस निरंतर रोटेशन के साथ रात भर सेते हैं.
  3. सुबह में, रोलर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 ग्राम पर अपकेंद्रित्र से संस्कृति को हटा दें. Centrifugation के बाद, पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  4. 1 मिलीलीटर resuspension (10% [v / v] ते समाधान, 10% [v / v] 1 एम LiAc समाधान) बफर और vortexing द्वारा मिश्रण में कोशिकाओं Resuspend.
  5. प्रत्येक तब्दील हो प्लाज्मिड और एक अतिरिक्त नियंत्रण परिवर्तन के लिए, एक microtube सेल निलंबन के 100 μl हस्तांतरण.
  6. प्रत्येक ट्यूब करने के लिए, एकल भूग्रस्त सामन शुक्राणु डीएनए (10 मिलीग्राम / एमएल) और (नियंत्रण ट्यूब के लिए छोड़कर) तब्दील हो प्लाज्मिड डीएनए के 250-500 एनजी के 5 μl जोड़ने.
  7. ध्यान से परिवर्तन (10 [v / वी] ते समाधान, 10% [v / v] 1 एम LiAc समाधान 80% 50% [v / v] [w v /] खूंटी समाधान% समाधान के प्रत्येक ट्यूब 650 μl को जोड़ने ) भंवर.
  8. 30 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए एक रोलर पर सेते हैं.
  9. हिलनेवाला से निकालें ट्यूबों, DMSO के 70 μl जोड़ने, मिश्रण और inverting ट्यूबों द्वारा 10-15 बार (कोशिकाओं को तोड़ने से बचने के भंवर नहीं).
  10. 42 एक में ट्यूबों रखें ° सी पूर्व गर्म पानी स्नान और 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  11. ट्यूबों को पानी के स्नान से निकालें और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें जगह.
  12. एक बार ट्यूबों नीचे ठंडा है, पर उनके कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 ग्राम अपकेंद्रित्र.
  13. ट्यूबों microcentrifuge के बाहर ले जाओ और सावधानी से चिपचिपा सतह पर तैरनेवाला का उपयोग कर एक pipettor हटायें.
  14. बाँझ दोहरा आसुत जल (DDW) के 150 μl में प्रत्येक ट्यूब के सेल गोली Resuspend है, और एक कृत्रिम पूरा मध्यम एक कार्बन स्रोत के रूप में 2% ग्लूकोज युक्त थाली पर और बिना सेल निलंबन फैल एमिनो एसिड या nucleotide के लिए है जो प्लाज्मिड प्रदान करता है prototrophy.
  15. प्लेटें 2 मिनट के लिए खुला छोड़ दो और उन्हें एक लामिना का प्रवाह हुड में शुष्क करने की अनुमति. दो - तीन दिनों के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.
  16. एक बार जब कालोनियों (1-2 मिमी व्यास) प्लेटों पर दिखाई है, प्रत्येक परिवर्तन से लगभग 10 एकल कालोनियों लेने और उन्हें एक ताजा प्लेट को हस्तांतरण. जब कालोनियों के हस्तांतरण, 2 सेमी x 2 सेमी पैच बनाने के लिए खमीर कोशिकाओं की एक बड़ी राशि की वृद्धि की अनुमति है. 30 ° C पर दो दिनों के लिए एक इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं.
  17. जब खमीर पैच हो गए हैं, इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालने और उन्हें parafilm साथ सील. प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है एक ताजा थाली करने के लिए हर 10-14 दिनों कालोनियों स्थानांतरण.

चतुर्थ. एक खमीर प्रोटीन तैयारी Immunoblot द्वारा effector अभिव्यक्ति सत्यापित निकालें

  1. एक 15 मिलीलीटर polypropylene उपयुक्त सिंथेटिक पूरा एक कार्बन स्रोत के रूप में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक मध्यम 3 मिलीग्राम से युक्त ट्यूब के लिए एक ताजा थाली से और एमिनो एसिड या जो प्लाज्मिड nucleotide के बिना एक खमीर कॉलोनी (1-2 मिमी व्यास) उठाओ पसंद की prototrophy प्रदान करता है. एक रोलर में संस्कृति ट्यूब प्लेस और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
  2. अगले दिन, रोलर से संस्कृति को हटाने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 ग्राम अपकेंद्रित्र. अपकेंद्रित्र से ट्यूबों निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  3. Vortexing द्वारा बाँझ DDW और मिश्रण के 3 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend.
  4. फिर अपकेंद्रित्र, बाँझ DDW के 3 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend कोशिकाओं त्यागने.
  5. एक नया 15 मिलीलीटर सिंथेटिक पूरा में 2% galactose और एक कार्बन स्रोत के रूप में 1% raffinose के साथ पूरक माध्यम से 3 मिलीग्राम से युक्त ट्यूब सेल निलंबन के 200 μl स्थानांतरण, और एमिनो एसिड या जो nucleotide के बिना पसंद के प्लाज्मिड prototrophy प्रदान करता है.Vortexing, जगह एक रोलर में, और 30 में रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस से मिक्स
  6. निम्नलिखित सुबह, एक microtube संस्कृति के 1 मिलीलीटर (या कम घनत्व संस्कृतियों के लिए और अधिक) हस्तांतरण. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 ग्राम पर हार्वेस्ट.
  7. यहाँ से, एक धूआं हुड में काम करने के लिए β-mercaptoethanol विषाक्त vapors साँस लेने से बचने के. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला एक pipettor का उपयोग हटाने और ठंडा lysis समाधान के 100 μl (4% [v / v] 5 एन NaOH, 0.5% [v / v] β-mercaptoethanol) में सेल गोली resuspend. Vortexing द्वारा सख्ती मिक्स और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  8. ऊष्मायन के दौरान एचसीएल की मात्रा (6 एन) 9-10 पीएच lysis बफर के 100 μl titering के लिए आवश्यक का निर्धारण करते हैं. इस उद्देश्य के लिए जगह उनमें से प्रत्येक में एक रैक और हस्तांतरण lysis बफर के 100 μl में 10 microtubes. एचसीएल (6 एन) के विभिन्न संस्करणों (1-10 μl) प्रत्येक ट्यूब और vortexing द्वारा मिश्रण जोड़ें. एक नमूना ले लो और पीएच सूचक पट्टी का उपयोग कर समाधान के पीएच की जाँच करें.
  9. ऊष्मायन अंत में, एचसीएल lysate vortexing द्वारा मिश्रण करने के लिए पिछले चरण (बेहतर सटीकता के लिए, ट्यूब के पक्ष में lysate में डालने टिप के बिना एचसीएल समाधान जगह) में निर्धारित मात्रा में जोड़ें.
  10. 3x नमूना बफर (30% [v / v] ग्लिसरॉल, 15% [v / v] β-mercaptoethanol, 37.5% की 50 μl जोड़ें [v v /] 500 मिमी Tris - एचसीएल पीएच = 6.8, 0.15% [w v / ] सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस] और bromophenol नीले रंग के lysate और vortexing (अगर समाधान पीले रंग बदल जाता है, इसका मतलब है कि पीएच बहुत कम है, और lysis समाधान के कुछ microliters के समाधान जब तक जोड़ा जाना चाहिए द्वारा मिश्रण करने के लिए कुछ अनाज) नीले रंग बदल जाता है).
  11. Lysate समाधान microtube के कवर में एक सुई के साथ एक छेद puncturing के बाद एक हीटिंग खंड पर 5 मिनट के लिए उबाल लें.
  12. हीटिंग ब्लॉक से microtube निकालें और समाधान के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
  13. Lysate समाधान भंवर और उसके बाद यह 10 सेकंड के लिए नीचे स्पिन. एसडीएस पृष्ठ एक जेल पर immunoblot विश्लेषण के लिए 30 μl लोड.

वी. परख खोलना effector प्रेरित विकास निषेध phenotypes को पता लगाने के लिए

  1. थाली से एक ताजा एक खमीर (1-2 मिमी व्यास) एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में कॉलोनी, ब्याज और टीका लगाना प्लाज्मिड अभिव्यक्ति ले लेने, सिंथेटिक पूरा एक कार्बन स्रोत के रूप में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक मध्यम और एमिनो बिना 3 मिलीलीटर एसिड या जो nucleotide प्लाज्मिड अभिव्यक्ति prototrophy प्रदान करता है. एक नियंत्रण खमीर तनाव एक खाली प्लाज्मिड ले जाने के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ. एक रोलर में संस्कृति ट्यूबों प्लेस में 30 डिग्री सेल्सियस निरंतर रोटेशन के साथ रात भर सेते हैं.
  2. अगले दिन, रोलर से संस्कृतियों को हटाने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 ग्राम पर अपकेंद्रित्र. अपकेंद्रित्र से ट्यूबों निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  3. Vortexing द्वारा बाँझ DDW और मिश्रण के 3 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend.
  4. Centrifugation और बाँझ DDW के 3 मिलीलीटर में कदम resuspend कोशिकाओं को दोहराएँ.
  5. उनके ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को निर्धारित करने के लिए, 900 μl DDW और भंवर युक्त microtube प्रत्येक संस्कृति के 100 μl हस्तांतरण. एक प्लास्टिक क्युवेट में ट्यूबों की सामग्री डालो और 600 एनएम के तरंग दैर्ध्य में absorbance के उपाय (संदर्भ के रूप में एक DDW के 1 मिलीलीटर से भरा क्युवेट का उपयोग). क्युवेट में संस्कृतियों के आयुध डिपो 600 गुणा 10 के कमजोर पड़ने कारक द्वारा द्वारा प्रारंभिक संस्कृतियों के 600 आयुध डिपो की गणना.
  6. अगला, प्रारंभिक संस्कृतियों के 600 आयुध डिपो पर आधारित है, सेल निलंबन के साथ एक आयुध डिपो 600 (1 मिलीलीटर) = 1.0 बाँझ microtubes में तैयार .
  7. 3 बाँझ 900 μl बाँझ DDW से भरा microtubes का उपयोग करके, तीन 10 गुना धारावाहिक dilutions (600 आयुध डिपो = 0.1, 0.01 और 0.001) (600 आयुध डिपो 1.0 =) के प्रत्येक कक्ष निलंबन से पिछले चरण में तैयार तैयार करते हैं .
  8. अमीनो एसिड या करने के लिए nucleotide जो पसंद की प्लाज्मिड prototrophy प्रदान करता है बिना दो सिंथेटिक पूरा मध्यम युक्त प्लेटों की तैयारी. एक थाली के माध्यम 2% ग्लूकोज और 2% और 1% galactose raffinose के साथ अन्य की थाली के साथ पूरक होना चाहिए. 20 मिनट के लिए एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में कमरे के तापमान पर प्लेटें सूखी और एक ग्रिड पर उन्हें जगह है.
  9. प्रत्येक संस्कृति के लिए, स्थान दोनों दमन और मीडिया उत्प्रेरण पर चार एक पंक्ति में dilutions से 10 μl.
  10. खोलना के बाद कई मिनट के लिए हुड में खुला प्लेटें छोड़ दें. जब स्पॉट सूख रहे हैं, प्लेट कवर और एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उन्हें 2-3 दिनों के लिए जगह है.
  11. ऊष्मायन के बाद, प्लेटें लेने के लिए और खमीर विकास का विश्लेषण. पहले पुष्टि है कि सेल घनत्व दमन मध्यम युक्त थाली पर समान हैं. फिर, संस्कृति के विकास उत्प्रेरण मध्यम युक्त थाली पर एक खाली वेक्टर ले जाने संस्कृति के साथ ब्याज की effector प्रोटीन व्यक्त की तुलना करें.

    नोट: effectors सेलुलर प्रक्रियाओं है कि मानक प्रयोगशाला विकास शर्तों के तहत खमीर विकास के लिए दर सीमित नहीं हैं लक्षित कर सकते हैं.ऐसे effectors के लिए विकास निषेध phenotypes की पहचान की अनुमति, मीडिया उत्प्रेरण यौगिकों कि खमीर सेलुलर कार्यों में परिवर्तन के साथ पूरक किया जा सकता है, इस प्रकार effectors को अपनी संवेदनशीलता बढ़ रही है. रसायन है कि संभवतः इस प्रक्रिया में एकीकृत किया जा सकता है की एक सूची के लिए, पार्सन्स एट अल देखें. 2 (2004).

छठी. प्रतिनिधि परिणाम

एक प्रतिनिधि परख का पता लगाने और विकास निषेध प्रकार III effectors की अभिव्यक्ति से प्रेरित phenotypes खोलना खमीर छवि में दिखाया गया हैं. 1. इस प्रयोग में, प्रकार III effectors AvrPto, HopAA1-1 और AvrE1 ग्राम नकारात्मक phytopathogenic जीवाणु Pseudomonas syringae pv टमाटर (पीएसटी) के centromere युक्त खमीर तनाव BY4741 में प्लाज्मिड pGML10 से व्यक्त किया गया है, और उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया खमीर के विकास को बाधित करने के लिए. व्यक्तिगत खमीर galactose inducible GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत pst प्रकार क्ष्क्ष्क्ष् effectors को व्यक्त या एक खाली वेक्टर युक्त संस्कृतियों serially और पतला (ग्लूकोज) दमन या उत्प्रेरण (galactose) मीडिया (1 छवि) पर मढ़वाया. मध्यम दमन पर, खमीर AvrPto और HopAA1-1 की अभिव्यक्ति के लिए plasmids ले उपभेदों नियंत्रण तनाव युक्त एक खाली सदिश के रूप में इसी तरह वृद्धि का प्रदर्शन किया. लेकिन एक ही माध्यम पर, खमीर AvrE1 ले जाने के एक थोड़ा कम वृद्धि प्रदर्शित शायद GAL1 प्रमोटर के रिसाव के कुछ डिग्री करने के लिए और AvrE1 के उच्च साइटोटोक्सिक प्रभाव से संबंधित है. उत्प्रेरण परिस्थितियों में, AvrE1 effector की अभिव्यक्ति एक कठोर विकास निषेध किसी भी कमजोर पड़ने में कालोनियों की कमी से परिलक्षित phenotype के कारण होता है. जैसा कि पहले Munkvold एट अल. 3, भी विकास की गंभीर निषेध के परिणामस्वरूप HopAA1-1 की अभिव्यक्ति, द्वारा मनाया जबकि AvrPto कोई असर नहीं दिखा था.

चित्रा 1
चित्रा 1. खमीर विकास स्यूडोमोनास syringae pv टमाटर. अभिव्यक्ति से कारण निषेध (पीएसटी) प्रकार III AvrE1 और HopAA1-1 effectors खमीर उपभेदों (BY4741) प्लाज्मिड pGML10 युक्त, या तो खाली या galactose-inducible AvrPto की अभिव्यक्ति के लिए ले जाने GAL1 संचालित कैसेट . HopAA1-1 या AvrE1, सिंथेटिक पूरा एक कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज (2%) के साथ पूरक मध्यम में रातोंरात बड़े हो रहे थे, और leucine कमी. संस्कृतियों धोया, 600 आयुध डिपो के लिए सामान्यीकृत थे = 1.0 और धारावाहिक 10 गुना dilutions सिंथेटिक पूरा ठोस leucine और युक्त ग्लूकोज (2%) की कमी, मीडिया या galactose (2%) और raffinose (1%) पर देखा गया था. फोटो 30 में विकास के 2 और 3 दिनों ° ग्लूकोज और galactose मीडिया में बढ़ती खमीर के लिए सी, क्रमशः के बाद ले जाया गया.

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Discussion

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इस प्रस्तुति में, हम कैसे प्रकार III बैक्टीरियल effector प्रोटीन और effector प्रेरित विकास निषेध phenotypes की पहचान कैसे की अभिव्यक्ति के लिए एक heterologous प्रणाली के रूप में नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae का उपयोग करने के लिए सचित्र. महत्वपूर्ण बात, इन phenotypes आनुवंशिक स्क्रीन में उपयोग किया जा सकता है खमीर विकास पर effectors के नकारात्मक प्रभाव के दमन की पहचान. दमन effector की या तो प्रत्यक्ष लक्ष्य या अध्ययन प्रोटीन है कि सेलुलर effector द्वारा प्रभावित प्रक्रियाओं में भाग लेने का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. पौधे और पशु बैक्टीरियल रोगज़नक़ों से कई प्रकार III effectors तिथि करने के लिए खमीर में व्यक्त किया गया है, और विकास निषेध उनमें से कई कारण phenotypes प्रक्रियाओं या रास्ते में है कि वे लक्ष्य 1,4 की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया. कई अध्ययनों में, खमीर में effector विषाक्तता भी सफलतापूर्वक किया गया था करने के लिए उपन्यास बैक्टीरियल 5 effectors की पहचान शोषण . इसके अलावा, effector प्रेरित विकास निषेध phenotypes रासायनिक पुस्तकालयों के यौगिकों कि 6 खमीर में effectors की विषाक्तता को दबाने के लिए स्क्रीन में दवाओं की खोज के लिए शोषण किया जा सकता है.

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Acknowledgments

यह काम इसराइल विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Difco Laboratories 212750
Peptone Difco Laboratories 211677
D-glucose Sigma-Aldrich G5767
Agar Difco Laboratories 214010
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Yeast nitrogen base w/o amino acids Difco Laboratories 291940
Yeast synthetic drop-out medium supplement Sigma-Aldrich Y2001
D-galactose Sigma-Aldrich G0750 >99%; <0.1% glucose
D-raffinose Sigma-Aldrich R0250 >98%
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
Uracil Sigma-Aldrich U0750
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-histidine Sigma-Aldrich H6034
DNA, single stranded, from salmon testes Sigma-Aldrich D7656
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879 Desiccate
Hydrochloric acid (HCl) Sigma-Aldrich H1758
Polyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich P4338
Lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich L4958
Tris (base) JT Baker 4109-02
Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
β-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B6131
Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) Merck & Co., Inc. 8.22050.1000
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430052 Sterile
Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) Sarstedt Ltd 67.742
Inoculation loop Sigma-Aldrich Z643009 Sterile
Parafilm Sigma-Aldrich P7543
pH indicator strip, pH 6.5-10.0 Merck & Co., Inc. 1.09543.0001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
  2. Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  3. Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
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  5. Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
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खमीर में बैक्टीरियल प्रकार III effectors की अभिव्यक्ति से प्रेरित विकास निषेध phenotypes की पहचान
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Salomon, D., Sessa, G. Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast. J. Vis. Exp. (37), e1865, doi:10.3791/1865 (2010).More

Salomon, D., Sessa, G. Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast. J. Vis. Exp. (37), e1865, doi:10.3791/1865 (2010).

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