Biology

आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

यह वीडियो और भौं चाकू के उपयोग सहित Xenopus laevis भ्रूण, आयोजक जानवर पोल explants की तैयारी के लिए तकनीक का इस्तेमाल एक विशेष विच्छेदन एक भौं का बना उपकरण को दर्शाता है. एक आसंजन परख कोडांतरण के लिए प्रोटोकॉल भी दिया जाता है, जो प्रमुख आसंजन अणुओं की उपस्थिति के लिए जांच सतह आयोजक या जानवर पोल कोशिकाओं है कि समुचित विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं पर मौजूद है.

Protocol

तैयारी आसंजन चेम्बर्स (पहले दिन / इंजेक्शन विच्छेदन)

आसंजन परख चेम्बर्स

यदि आप एक पारंपरिक परिसर माइक्रोस्कोप (चरण ऊपर ऑप्टिकल रेखांकित) है, यह ncecessary है बनाने के लिए एक कम ऊंचाई आसंजन चैम्बर के रूप में निम्नानुसार है. खुर्दबीन उल्टे प्रकाशिकी का उपयोग अगर, तो "NUNC लैब टेक संभाग coverglass" बस, प्रयोग किया जा सकता है और # 1 कदम को छोड़ - 2.

एक 40 x 24mm कवर पर्ची पर "प्रेस करने के लिए सील सिलिकॉन विसंवाहक" संलग्न. मजबूती से साफ benchtop कवर पर पर्ची करने के लिए विसंवाहक प्रेस और दूसरी तरफ से देखने के लिए यकीन है कि विसंवाहक किसी भी हवा - बुलबुले के बिना पूरी तरह जुड़ा हुआ है.
वैकल्पिक: वाटमान फिल्टर और सूखी चक्र में कागज आटोक्लेव के साथ एक गिलास पेट्री डिश बाँझ आसंजन कक्षों में रखो . उन्हें आरटी के लिए शांत हो जाओ.

चैंबर कोटिंग

एक autoclaved आसंजन चैम्बर के केंद्र पर (10mg/ml) cadherin या fibronectin (20mg/ml) के समाधान के काम कर रहे हैं, sigmacoated पीले सुझावों का उपयोग करने के 200ml छोटी बूंद रखो. आरटी में 4 घंटे के लिए सेते हैं.
Cadherin या fibronectin समाधान बाहर ले लो और एक 1.5ml ट्यूब को हस्तांतरण. यह समाधान अगले दो सप्ताह के लिए reused किया जा सकता है.
1x में एमबीएस एच 4% BSA के 500ml बांटना चैम्बर ब्लॉक. आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
BSA समाधान Aspirate. 1x एमबीएस - एच के 500ml के साथ चैम्बर दो बार धोएं. दूसरा धोने के बाद, एमबीएस एच के सबसे aspirate (नहीं पूरी तरह से), और एक मोहरबंद कंटेनर में 4 º सी. पर दुकान 3 दिन - यह आसंजन चैम्बर अगले 2 के लिए अच्छा है.

विच्छेदन और पशु कैप Explants की हदबंदी

0.1x एमबीएस - एच में इंजेक्शन भ्रूण सेते हैं, autoclaved एमबीएस एच 1x से पतला है, के रूप में गैर - autoclaved मध्यम कुछ समय से छोटे रोगाणु कि dissociated जानवर टोपी कोशिकाओं को परेशान कर सकते हैं किया जाता है.
60mm व्यंजन के साथ 1x बार्थ agarose प्लेटें और सीएमएफ - एमबीएस agarose प्लेटें, कम से कम के रूप में अपने नमूनों की संख्या के रूप में कई. 1x बार्थ प्लेटें autoclaved 1x एमबीएस एच डालो. सीएमएफ - एमबीएस प्लेटों के लिए, सीएमएफ - एमबीएस 10ml डालना.
जब भ्रूण 8.5 मंच बन एक 1x बार्थ थाली में पशु टोपियां विदारक शुरू करते हैं. 10 - नमूने के अनुसार 15 explants आम तौर पर कर रहे हैं एक प्रयोग के लिए पर्याप्त है.
सीएमएफ - एमबीएस थाली करने के लिए पशु टोपी explants स्थानांतरण. के लिए 45 explants सेते - 60 मिनट तक explants पूरी तरह से अलग हैं. हर 15 मिनट में कोमल आंदोलन हदबंदी में मदद मिलेगी.

सेल आसंजन परख

कोशिकाओं सीडिंग: 1x एमबीएस - एच के आसंजन ऊपर वर्गों, आसंजन परख मंडलों और चैंबर कोटिंग में चरणों में तैयार कक्ष 500ml बग़ैर. थाली सीएमएफ - एमबीएस से आसंजन sigmacoated और कटा बंद पीले सुझावों के साथ कक्ष का उपयोग कर P200 dissociated जानवर टोपी कोशिकाओं स्थानांतरण.
वैकल्पिक: यदि संभव हो तो, ध्यान से मध्यम चूसना हवा करने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के बिना आधे रास्ते करने के लिए 2 / 3 लगभग . लगभग एक ही राशि के ताजा एमबीएस - एच, लगता है कि ^{मध्यम} पर्याप्त 2 ^Ca शामिल ⁺ और ² मिलीग्राम + . जोड़ें
आरटी पर 90 मिनट - 45 के लिए सेते हैं. कोशिकाओं कभी कभी की जाँच के लिए यदि वे नीचे की सतह के लिए संलग्न कर रहे हैं.
अब आप एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की तस्वीर ले जा सकते हैं.
एक ग्रिड स्लाइड गिलास पर आसंजन कक्ष रखो. ग्रिड स्लाइड के एक कोने में एक आसंजन चैम्बर के कोनों संरेखित करें. गणना और कई अलग अलग ग्रिड में संलग्न कोशिकाओं की संख्या में रिकॉर्ड.
एक बड़े प्लास्टिक की बाल्टी (जैसे, Tupperware, आदि) में एमबीएस एच के 1L डालो. धीरे बाल्टी के नीचे आसंजन स्लाइड कक्ष डाल दिया. कक्षीय हिलनेवाला पर यह कम गति (- 60rpm 50) पर पांच मिनट के लिए घुमाएँ.
आसंजन कक्ष ग्रिड स्लाइड पर वापस रखो ग्रिड स्लाइड के समान कोने के कक्ष के एक ही कोने aligning, के रूप में इस अनुभाग में, कोशिका आसंजन परख के कदम # 5 में किया गया था. जो एक ही ग्रिड है कि आप धोने से पहले गिनती है पर संलग्न रहते कोशिकाओं की संख्या गिनो. कि धोने के बाद संलग्न रहते कोशिकाओं का प्रतिशत की गणना.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting