Biology

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Protocol

Preparando Chambers Adesão (um dia antes da injecção / dissecção)

Ensaio de aderência Chambers

Se você tem um microscópio composto convencional (óptico localiza acima do palco), é ncecessary para fazer uma baixa altura câmara de adesão da seguinte forma. Se estiver usando o microscópio invertido óptica, então "NUNC Lab-Tek lamela Chambered" pode apenas ser usado, e ignore as etapas # 1 - 2.

Anexar um dos "press-to-vedação isolante de silicone" em uma lamínula 40 x 24mm. Pressione firmemente o isolador para a lamínula na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamente ligado sem-bolhas de ar.
Opcional: Coloque as câmaras de adesão em uma placa de Petri de vidro com papel de filtro Whatman e autoclave no ciclo de seca para esterilizar. Resfriá-los para baixo para RT.

Revestimento da Câmara

Coloque uma gota de 200ml de solução de trabalho de caderina (10mg/ml) ou fibronectina (20mg/ml) para o centro de uma câmara de adesão autoclavada, utilizando sigmacoated dicas amarelo. Incubar a RT por 4 horas.
Retire a solução caderina ou fibronectina e transferir para um tubo de 1,5 ml. Esta solução pode ser reutilizado para próximas duas semanas.
Dispense 500ml de BSA 4% em 1x MBS-H para bloquear a câmara. Incubar a RT por 1 hora.
Aspirar a solução de BSA. Lave a câmara com 500ml de 1x MBS-H duas vezes. Depois da segunda lavagem, aspirar a maioria dos MBS-H (não completamente), e armazenar em um recipiente fechado a 4 º C. Esta câmara de adesão é bom para os dois próximos - 3 dias.

Dissecção e dissociação de explantes Cap animal

Incubar os embriões injetados em 0,1 x MBS-H, diluídos a partir do 1x autoclavado MBS-H, como não-autoclavado médio sometime carrega germes pouco que pode perturbar as células cap dissociada animal.
Faça agarose 1x Barth e placas CMF-MBS agarose com pratos 60mm, pelo menos tantos como o número de suas amostras. Despeje autoclavado 1x MBS-H para placas 1x Barth. Para placas MBS-CMF, despeje 10ml de CMF-MBS.
Quando os embriões tornam-se palco 8,5, iniciar dissecar as tampas de animal em uma placa de Barth 1x. 10-15 explantes por amostras são geralmente suficiente para uma experiência.
Transferir os explantes cap animal para uma placa CMF-MBS. Incubar os explantes de 45-60 minutos, até que os explantes são completamente dissociados. Agitações suave em cada 15 minutos vai ajudar a dissociação.

Ensaio de adesão celular

Semeadura das células: Dispense 500ml de 1x MBS-H para a câmara de adesão preparada nas etapas nas seções acima, Chambers Ensaio de Adesão e revestimento da Câmara. Transferência das células animais cap dissociada da placa CMF-MBS para a câmara de adesão usando P200 com dicas sigmacoated e picados-off amarela.
Opcional: Se possível, cuidadosamente sugar até o meio até aproximadamente 2 / 3 para metade, sem expor as células para o ar. Adicionar aproximadamente a mesma quantidade de doce MBS-H, para se certificar de que o meio contém suficientes Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
Incubar a RT para 45-90 minutos. Verifique as células ocasionalmente para ver se eles são inerentes a superfície inferior.
Agora você pode tirar a foto das células sob um microscópio.
Coloque a câmara de aderência em um copo de slides grid. Alinhar um dos cantos da câmara de adesão a um canto do slide grid. Contar e registrar o número de células associadas em diversas redes diferentes.
Despeje 1L de MBS-H em um balde grande de plástico (por exemplo, Tupperware, etc.) Com cuidado, coloque a câmara de slides adesão ao fundo do balde. Girá-lo no agitador orbital por cinco minutos em baixa velocidade (50 - 60rpm).
Coloque a câmara de adesão de volta no slide grid, alinhando o mesmo canto da câmara para o mesmo canto do slide grid, como foi feito no passo 5 desta seção Ensaio de Adesão, Cell. Contar o número de células que permanecem ligados na mesma grelha que você tem contado antes da lavagem. Calcular a porcentagem de células que permanecem ligados após a lavagem.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting