Summary
本视频演示所使用的技术准备从非洲爪蟾胚胎,包括使用的眉刀的组织者和动物极植 - 一个专门的清扫工具的眉。也给出了组装粘附实验的协议,目前表面上的组织者或动物极细胞,适当发展的关键,关键粘附分子的存在探头。
Protocol
准备附着力钱伯斯(前一天注射/夹层)
黏附实验房
如果你有一个传统的复合式显微镜(舞台上方的光学定位),它是ncecessary低高度粘连室如下。如果使用倒置光学显微镜,然后“NUNC实验室TEK腔玻璃罩”可以被使用,并跳过步骤#1 - 2。
- 附上“压密封的硅绝缘体”40 x 24毫米盖玻片之一。用力按下绝缘体清洁台式盖玻片,从另一个侧面看,以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。
- 可选:将粘附在一个玻璃的Petri盘的Whatman滤纸和干燥周期中的反应釜消毒室。冷却下来到RT。
涂总商会
- 把200毫升液滴的钙粘蛋白(10mg/ml的)或纤维连接蛋白(20mg/ml)到蒸压粘连室的中心工作的解决方案,使用sigmacoated黄芽。在室温下孵育4小时。
- 取出的钙粘蛋白或纤维连接蛋白解决方案,并转移到1.5ml管。未来两个星期内,该解决方案可重复使用。
- 免除1X按揭证券 - H 500ml的4%BSA块室。在室温下孵育1小时。
- 吸BSA溶液。 500毫升1X MBS - H的清洗室两次。第二次洗涤后,吸出的MBS - H的大部分(不完全),并储存在密封容器内4℃这粘连商会是在未来2 - 3天。
动物第植体解剖和离解
- 孵育0.1倍MBS - H的注入胚胎,从蒸压1X按揭证券- H的稀释,非蒸压中期的某个时候进行小的细菌,可以扰乱分离的动物上限细胞。
- 60毫米菜1X巴特的琼脂糖板和CMF -按揭证券琼脂糖板,至少为样品的数量很多。蒸压1X MBS - H倒入1X巴特的板块。 CMF -按揭证券板块,倒入10毫升CMF -按揭证券。
- 当胚胎成为8.5阶段,开始在1X巴特板解剖的动物帽。 10 - 15%的样品植通常就足够了一项实验。
- 将动物第植到CMF的按揭证券板块。育植的45 - 60分钟,直到植是完全分离的。在每15分钟的温和鼓动将有助于解离。
细胞粘附实验
- 播种细胞:分装500毫升1X按揭证券 - H以上的部分,粘附实验分庭和涂料商会的步骤准备粘附室。传输从CMF的按揭证券板块的分离的动物第细胞粘附室使用一个sigmacoated和切碎黄芽P200。
- 可选:如果可能的话,小心吸中期约2 / 3中途不暴露在空气中的细胞, 。新增大约相同数量的新鲜MBS - H,以确保中期含有足够的钙2 +和Mg 2 +。
- 在室温下孵育45 - 90分钟。偶尔检查细胞,看看他们是否附加的底部表面。
- 现在你可以利用细胞在显微镜下的图片。
- 把网格载玻片上的附着力室。对齐粘附室的角落之一电网幻灯片的一个角落。点算并记录在几个不同的网格的贴壁细胞数量。
- 倒在一个大塑料桶(例如,特百惠等)的MBS - H 1L。轻轻把粘附幻灯片室桶的底部。旋转的轨道摇床在低速(50 - 60rpm)5分钟。
- 把粘连室对电网的幻灯片,调整室的角落电网幻灯片相同的角落,在本节中,细胞粘附实验步骤#5。计数保持在同一电网连接,你有洗涤之前算细胞数目。计算保持后洗去附着的细胞的百分比。
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
1x MBS-H | Buffer | Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave. | ||
CMF-MBS | Buffer | This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave. | ||
1% agarose/1x Barth’s plates | as many as the number of samples | |||
1% agarose/CMF-MBS plates | as many as the number of samples | |||
E-Cadherin/Fc chimera | Reagent | Sigma-Aldrich | E-2278 | Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. |
Fibronectin, 0.1% solution | Reagent | Sigma-Aldrich | F-1141 | This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results. |
4% BSA /MBS-H | Buffer | BSA: molecular biology grade fraction V | ||
Sigmacoted yellow tips | Tool | |||
No.1 cover slips | 40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm | |||
Press-to-seal silicon insulator | Tool | Glace Bio-Labs | JTR20-2.5 | 2.5 mm depth x 20 mm diameter |
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass | Tool | Fisher Scientific | 12-565-471 | 2 wells/slides |
Grid slide glass | Tool | or Finder graticule for cell counting |