Biology

Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

וידאו זה מדגים את טכניקה המשמשת להכנת מארגן מוט explants חיים מעוברים Xenopus laevis, כולל שימוש בסכין גבה - כלי לנתיחה המקצועית עשוי גבה אחת. פרוטוקול להרכבת assay הידבקות ניתנת גם, אשר בדיקות נוכחות של מולקולות הדבקה המפתח הנוכחי על מארגן את פני השטח או מוט חיה התאים הם קריטיים להתפתחות תקינה.

Protocol

הכנת לשכות הדבקה (יום לפני ההזרקה / דיסקציה)

Assay הדבקה צ'יימברס

אם יש לך מיקרוסקופ מתחם קונבנציונלי (מאתרת אופטי מעל הבמה), הוא ncecessary לבצע הדבקה נמוכה גובה קאמרית כדלקמן. אם באמצעות מיקרוסקופ הפוך אופטיקה, ואז "NUNC Lab-Tek Coverglass החדרים" יכול להיות בשימוש, לדלג על שלבים 1 - 2.

צרף אחד "מבדד עיתונאים חותם סיליקון" על פתק 40 x 24mm לכסות. היטב בעיתונות מבודדת להחליק את מכסה על benchtop נקי להסתכל מהצד השני כדי לוודא כי מבודדת מחוברת לחלוטין, ללא בועות אוויר.
אופציונלי: שים לתאי הידבקות בצלחת פטרי עם נייר זכוכית מסנן Whatman ו החיטוי במחזור יבש לעקר. מגניב אותם עד RT.

ציפוי הקאמרית

שים טיפה 200 מ"ל של עבודה פתרון של cadherin (10mg/ml) או פיברונקטין (20mg/ml) על במרכז החדר הידבקות autoclaved, באמצעות טיפים צהוב sigmacoated. לדגור על RT במשך 4 שעות.
קח את הפתרון cadherin או פיברונקטין והעברת צינור 1.5ml. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר במשך השבועיים הקרובים.
לוותר 500ml של BSA 4% 1x MBS-H לחסום את החדר. לדגור על RT במשך שעה 1.
לשאוב את הפתרון BSA. שטפו את החדר עם 500ml של 1x MBS-H פעמיים. לאחר לשטוף את השני, ישאפו רוב MBS-H (לא לגמרי), ולאחסן במכל אטום על 4 º C. זה תא הידבקות טובה עבור 2 הבא - 3 ימים.

Dissection ו דיסוציאציה של Explants שווי בעלי חיים

דגירה עוברים מוזרק 0.1x MBS-H, בדילול מן 1x autoclaved MBS-H, כלא autoclaved בינוני מתישהו נושאת חיידקים קטן שיכול להפריע כובע התאים ניתק בעלי חיים.
הפוך את agarose 1x בארת' של צלחות CMF-MBS agarose צלחות עם מנות 60mm, לפחות כמספר במספר דגימות שלך. יוצקים autoclaved 1x MBS-H על צלחות 1x של בארת'. עבור CMF-MBS צלחות, לשפוך 10 מ"ל של CMF-MBS.
כאשר עוברים הופכים בשלב 8.5, להתחיל לנתח את המכסים בעלי חיים צלחת בארת' של 1x. 10-15 explants לכל דגימות הן בדרך כלל מספיק עבור ניסוי.
מעבירים את הכובע explants חיה לצלחת CMF-MBS. דגירה explants עבור 45-60 דקות, עד explants הם ניתק לחלוטין. בהסתה עדין בתוך כל 15 דקות יעזור דיסוציאציה.

הדבקה Cell Assay

מתזמן את התאים: לוותר 500ml של 1x MBS-H לחדר הדבקה מוכנים של השלבים בסעיפים לעיל, Assay לשכות הדבקה וציפוי הקאמרית. העברת כובע התאים ניתק חיה מהצלחת CMF-MBS לחדר הדבקה באמצעות P200 עם טיפים צהובים sigmacoated ו הקצוצות.
אופציונלי: אם אפשר, בזהירות למצוץ את בינוני עד כ 2 / 3 ל באמצע הדרך, בלי לחשוף את התאים באוויר. מוסיפים בערך אותה כמות של טרי MBS-H, כדי לוודא בינוני מכיל מספיק Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +.}
לדגור על RT עבור 45-90 דקות. בדוק את התאים מדי פעם כדי לראות אם הם מצרף אל פני השטח התחתון.
עכשיו אתה יכול לקחת את התמונה של התאים תחת מיקרוסקופ.
שים את תא הדבקה על זכוכית שקופית הרשת. יישר באחת הפינות של החדר הידבקות לפינה של השקופית הרשת. הרוזן ולהקליט את מספר התאים המחוברים לרשתות שונות.
יוצקים 1 ליטר של MBS-H בתוך דלי פלסטיק גדול (למשל, פלסטיק וכו '). בעדינות את תא שקופיות הידבקות לתחתית הדלי. סובב אותו על שייקר מסלולית במשך חמש דקות במהירות נמוכה (50 - 60rpm).
שים את תא הידבקות בחזרה בשקופית רשת, יישור מאותה פינה של החדר לפינה אותו להחליק את הרשת, כפי שנעשה בשלב 5 של זה Assay, סעיף Cell הדבקה. ספירת התאים שנותרו מחוברים על הרשת באותו שיש לך לספור לפני הכביסה. חישוב אחוזי התאים נשארים צמודים לאחר הכביסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting