Única unidade de In vivo Gravações do quiasma óptico de rato

Summary

Células ganglionares da retina transmitir informações visuais do olho para o cérebro com seqüências de potenciais de ação. Aqui, demonstramos como gravar os potenciais de ação das células ganglionares única

Abstract

Informações sobre o mundo visual é transmitida para o cérebro em seqüências de potenciais de ação em axônios de células ganglionares da retina que compõem o nervo óptico.

Protocol

Parte I: Fabricação de tungstênio-in Glass-Eletrodos

1. Um anel de grafite é colocado em um copo cheio de uma solução concentrada de nitrato de sódio (0.71g/mL) e hidróxido de potássio (0.34g/mL) dissolvido em água ^1, eo copo é colocado sob o braço de costura de uma máquina de costura modificado .
2. Fio de tungstênio (0,5 mm de diâmetro, comprimento 6cm) é gravado para o braço de costura para que ele seja parcialmente imerso (1-2cm) em solução.
3. 2V são aplicados em todo o fio de tungstênio, anexando uma liderança positiva para o braço de costura e uma liderança negativa para o anel de grafite.
4. A máquina de costura é ligado e se o fio de tungstênio é mergulhado repetidamente na solução a uma taxa de aproximadamente 4Hz para 2 min, o que eletroliticamente grava o metal a uma ponta afiada.
5. O fio gravado é colocado em um micromanipulador manual eo ponto alinhado sob a orientação microscópica (40x) com o eixo de uma pipeta de vidro (0,25 mm OD, 0,175 milímetros ID) puxado para uma ponta de 1 milímetro com um puxador de vidro. Para impedir o movimento durante a inserção do fio, o vidro está temporariamente preso ao estágio do microscópio com putty.
6. O arame é cuidadosamente avançado na extremidade unpulled do vidro, para baixo o eixo, e através da abertura 1 Hm Um pequeno pedaço de vidro é visto como quebrar a ponta no vídeo, indicando um ajuste apertado do tungstênio no vidro. O fio deve se estender em torno de 5-10mm além da ponta para as gravações de ratos de fibra óptica.
7. Cianoacrilato é aplicada ao final unpulled do vidro e após o endurecimento da impedância elétrica é medido, onde eletrodos 1MΩ geralmente funcionam melhor.

Parte II: Setup estereotáxica e Gravações Train de Spike

1. O sistema de exibição de estímulo é ilustrado no vídeo, junto com o aparelho estereotáxico e microdrive para o posicionamento e diminuindo o eletrodo no cérebro.
2. Para realizar gravações de trem da retina spike o rato é anestesiado e, mais tarde paralisado. Procedimentos-padrão (não ilustrado) são usados ​​para a inserção cirúrgica de uma cânula veia femoral para a entrega da droga e uma cânula (Y-tubo) traqueal para ventilação mecânica durante a paralisia. Os experimentos são terminal para o animal.
3. Após os procedimentos de preparação, o animal é colocado sobre o cobertor de aquecimento ea cabeça é fixada na posição estereotáxica, como definido pelo cérebro de rato atlas ^2, com orelha e barras de dente.
4. A sonda retal é inserido, que controla a manta de aquecimento através de uma unidade de controle homeotérmicos que mantém a temperatura corporal a 37 ° C.
5. Agulha de metal são usados ​​como leva a medir a freqüência cardíaca e eletrocardiograma monitor.
6. A pele é aberto na parte superior do crânio e da interseção de placas de crânio (bregma) é exposto. Um quadro de trave de design personalizado é fixado no local, um círculo é marcado no crânio em torno begma através de um buraco na trave e no travessão está temporariamente removidos.
7. O sistema é calibrado estereotáxica, posicionando a agulha guia sobre bregma. Um buraco de 5 mm é no crânio perfurado no local marcado e osso é removida, expondo o cérebro. Um anel fina de massa é colocada em torno da abertura no crânio para formar uma vedação em torno do buraco na trave, que é reposto no lugar.
8. Se o animal tem estado em um avião estável de anestesia por algum tempo, é injetado com paralítico a fim de impedir os movimentos dos olhos durante a coleta de dados. Após a respiração pára o animal está sob ventilação mecânica. Um programa personalizado faixas parâmetros ventilatórios e fisiológicos durante todo o experimento e informa o pesquisador se a ação compensatória é necessário nenhum parâmetro deve ir para fora dos níveis normais.
9. A agulha guia é atrasaram com o eletrodo de tungstênio e baixou para o cérebro. Após a penetração do cérebro do buraco barra está cheia de agar (não mostrado), eo conjunto microdrive é preso à trave para a estabilidade mecânica. O eletrodo de tungstênio é então lentamente avançado (2μm/sec) a agulha guia até a ponta é de cerca de 8-9mm abaixo do crânio, onde o quiasma óptico está localizado.
10. Trens de Spike pertencentes a células ganglionares da retina são identificados por sua resposta a estímulos visuais. Após o isolamento de uma única fibra óptica do campo receptivo da célula registrado é mapeado no espaço visual e suas propriedades de resposta são caracterizados com grades à deriva ou outros padrões visuais de interesse. A estabilidade do sistema permite a única unidade de gravações de várias horas ^3.

Materiais

Adulto ratos Brown-Norway (250-400g) foram comprados de um fornecedor comercial e alojados em um mercado regulamentado (12/12) ciclo claro / escuro. A anestesia foi induzida com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de ketamina e xilazina (70 e 2 mg / kg, respectivamente, Henry Schein Inc) e mantidos para a duração da experiment com uma infusão intravenosa de ketamina e xilazina (30 e 1 mg / kg / hr) misturado com dextrose, soro fisiológico, e trietiodeto galamina (40 mg / kg / hr, Fischer Inc) através de um cateter (0,13 milímetros OD, Small Parts Inc ) na veia femoral direita. Galamina está incluída na mistura para paralisar os movimentos dos olhos. A taxa de infusão da bomba (WPI Inc) foi ajustada conforme necessário para manter um avião estável de anestesia, avaliada pela freqüência cardíaca e variabilidade da pressão arterial. Depois de paralisia, o animal era ventilado mecanicamente (Harvard Apparatus, Modelo 683) através de uma cânula traqueal em 60-80 respirações / min (2cc volume), com a taxa ajustada conforme necessário para manter end-tidal CO ₂ medido com uma linha de in- capnometer (Novametrix Inc, modelo 710Sp) a 30%. Temperatura corporal foi regulamentada através de um sistema homeotérmicos cobertor controle (Harvard Apparatus Inc). Temperatura corporal, end-tidal freqüência cardíaca CO _2, e pressão arterial foram continuamente monitorizadas durante todo o experimento por um programa LABVIEW. Estímulos visuais foram apresentados em um Sony Multiscan 17e monitor CRT (média de luminância de 30 cd / m ²⁾ rodando a 100 Hz com uma resolução de 800x600 pixels. Aquisição de dados e saída do monitor foram controlados com software personalizado escrito em Matlab e LabView em conjunto com um processador de imagem de vídeo (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) e caixa de ferramentas Psicofísica ^4. O animal viu a tela de estímulo (40,4 x 30,2 cm) a uma distância de 16,5 centímetros por meio de lentes de contato (Ocular Instruments Inc), e solução oftálmica foi aplicado periodicamente durante o experimento para manter os olhos úmidos. O campo visual acessível a estimulação foi maximizada por inverter a montagem do animal em um aparelho estereotáxico (Stoelting Co) 14 centímetros elevada acima da superfície de uma mesa flutuante (TMC Inc) e configuração do monitor em um trenó personalizados que se movia sobre a mesa, juntamente um arco ± 100 graus sobre o nariz. Isto proporcionou um campo de exibição repositionable que se estendeu de 60 graus acima e 35 graus abaixo do nível dos olhos e ± 42 graus lateralmente do centro de monitor. Electodes tungstênio foram fabricadas com fios obtidos a partir de pequenas peças Inc e vidro de borosilicato personalizado obtido a partir de Friedrich e Inc. Dimmock Um padrão micropippete extrator (Sutter Instruments, modelo P-97) foi usado para dar forma a ponta de vidro. O testador da impedância do eletrodo foi comprado de Bak-Electronics. Eletrodos foram avançadas com um microdrive sistema motorizado (Newport Inc, StepperMike). Electrocardiograma e sinais de nervo óptico foram amplificados e filtrados com um amplificador de alta impedância de entrada multieletrodo (FHC Inc, X-Cell 3x4). Batimentos cardíacos foram detectados com um discriminador janela (WPI Inc, modelo 121). Potenciais de ação do nervo foram detectados e hora com resolução de 0,1 ms por um pico digitais discriminador (FHC Inc, APM). O discriminador pico foi fechado por um sinal de disparo do processador de imagem de vídeo para que os tempos estavam trancadas pico ao estímulo.

Discussion

Gravações de fibra óptica são uma abordagem atrativa para abordar questões experimental sobre a codificação e transmissão de informação da retina que requerem um olho intacto. Além disso, as propriedades de sinalização de ambos os olhos pode ser estudada em praticamente no mesmo estado fisiológico se o eletrodo está posicionado no quiasma óptico e das vias onde a atividade de cruzadas e descruzadas fibras do nervo óptico pode ser gravado com um único eletrodo de penetração. Gravações de fibra óptica são comuns em gatos, mas não em outros modelos populares animais utilizados em pesquisa de visão, tais como roedores, talvez devido ao seu pequeno tamanho. Nós tentamos uma variedade de eletrodos comerciais de impedância similares e material, nenhum dos quais foram bem sucedidos em escolher a atividade única fibra em ratos, e muito menos gravá-la por várias horas como o nosso pode eletrodos. Isto implica que a geometria especial do nosso eletrodos, que têm uma ponta longa e afiada, em oposição à ponta larga blunt típicos os comerciais, é importante para o isolamento fiável e estável de células ganglionares trens axônio espiga. Além de mostrar como fabricar esses eletrodos, que ilustram o nosso sistema de design personalizado para estereotáxica in vivo pesquisa visual neurofisiológicos. O sistema é construído para proteger o microeletrodo de alta impedância de vibração ambiental e de ruído eletromagnético. Isto é crítico para a gravação do potencial de ação produzido por pequenos axônios (em comparação com os corpos celulares) durante um período de tempo prolongado, especialmente com um monitor de computador posicionado nas proximidades. Fá-lo com excepcional estabilidade e sinal-ruído, com tempos de gravação típica de uma hora ou mais e os níveis de ruído na ordem de dezenas de microvolts. Estas características tornam a configuração particularmente útil para pesquisadores com o objetivo de registrar a visão in vivo a partir de fibras nervosas da retina ou outras regiões do cérebro.