Single-enhet In vivo Inspelningar från Optic Chiasm av Rat

Summary

Retinal ganglion celler överför visuell information från ögat till hjärnan med sekvenser av aktionspotentialer. Här visar vi hur du spelar de åtgärder potential enda ganglion celler

Abstract

Information om den visuella världen överförs till hjärnan i sekvenser av aktionspotentialer i näthinnan axoner ganglion celler som bildar synnerven.

Protocol

Del I: Tillverkning av Tungsten av glas elektroder

1. En grafit ring placeras i en bägare fylld med en koncentrerad lösning av natriumnitrat (0.71g/mL) och kaliumhydroxid (0.34g/mL) upplöst i vatten ^1, och bägaren placeras under sy armen av en modifierad symaskin .
2. Volfram tråd (0,5 mm diameter, 6cm längd) är tejpad på sy armen så att det delvis är nedsänkt (1-2cm) i lösning.
3. 2V tillämpas i hela volfram tråd genom att fästa en positiv leda till att sy arm och en negativ leda till grafit ringen.
4. Symaskinen är påslagen och volfram tråden doppas upprepade gånger i lösning med en hastighet av ~ 4Hz i 2 min, som elektrolytiskt etsar den metall som en vass spets.
5. Den etsade tråden placeras på en manuell mikromanipulator och precis linje i mikroskopiska vägledning (40x förstoring) med axeln av ett glas pipett (0,25 mm OD, 0.175mm ID) drog till en 1mm spets med ett glas avdragare. Att inte rör sig under tråd insättning är glaset tillfälligt fast i mikroskop scenen med kitt.
6. Tråden är noga långt in i unpulled slutet av glas, ner i schaktet, och genom 1μm öppna en liten bit av glaset ses att bryta spetsen i videon, vilket indikerar en tajt passform av volfram i glaset. Tråden ska gå runt 5-10mm utanför tips för råttan optisk fiber inspelningar.
7. Cyanoakrylat appliceras på unpulled slutet av glaset och efter härdning den elektriska impedansen mäts, där 1MΩ elektroder som vanligtvis fungerar bäst.

Del II: Stereotaxic Setup och Spike Inspelningar Train

1. Den stimulans displaysystem illustreras i videon, tillsammans med stereotaxic apparater och Microdrive för positionering och sänka elektroden i hjärnan.
2. För att utföra näthinnan Spike tåg inspelningar råttan är sövda och senare förlamad. Standardprocedurer (visas inte) används för kirurgiska införa en femoral ven kanyl för drug delivery och ett luftstrupen (Y-tube) kanyl för mekanisk ventilation vid förlamning. Experimenten är terminalen för djuret.
3. Efter förberedande förfaranden, är djuret placeras på värme filt och huvudet är fast i stereotaxic position, enligt råtthjärna atlas ^2, med öron och barer tand.
4. Den rektala proben sätts in, de kontroller som värme filt via en homeothermic styrenhet som håller kroppstemperatur vid 37 ° C.
5. Metall nål används som leder till att mäta EKG och övervaka hjärtfrekvens.
6. Huden är öppen på toppen av skallen och skärningspunkten mellan skallen plattor (bregma) utsätts för. En specialdesignade ribban ram är satt på plats, är en cirkel markerad på skallen runt begma genom ett hål i ribban och ribban är tillfälligt avlägsnas.
7. Det stereotaxic systemet kalibreras genom att placera guiden st över bregma. En 5-mm hål borras in i skallen på den markerade platsen och benet tas bort, att utsätta hjärnan. En tunn ring av spackel placeras runt öppningen i skallen för att bilda en tätning runt hålet i ribban, som återställs på plats.
8. Om djuret har legat på en stabil plan för anestesi ett tag, är det injiceras med paralytisk för att förhindra ögonrörelser under datainsamlingen. Efter att andningen stannar djuret mekaniskt ventilerad. Ett anpassat program spår ventilation och fysiologiska parametrar under hela försöksperioden och informerar försöksledaren om kompenserande åtgärder behövs bör alla parametrar går utanför normala nivåer.
9. Guiden Nålen är backloaded med volfram elektroden och sänks ner i hjärnan. Efter hjärnan inträngande ribban hålet fylls med agar (visas inte), och Microdrive monteringen klämmas mot ribban för mekanisk stabilitet. Den volfram elektroden sedan sakta avancerat (2μm/sec) ut guiden nålen tills spetsen är ca 8-9mm nedanför skallen, där synnerven chiasm finns.
10. Spike tåg tillhör retinal ganglion celler identifieras genom sina svar på visuella input. Vid isolering av en enda optisk fiber den receptiva fält på den inspelade cellen är kartlagt i visuella rummet och dess svar egenskaper kännetecknas med driver trallar eller andra visuella mönster av intresse. Stabiliteten i systemet tillåter en enda enhet inspelningar av flera timmar ^3.

Material

Vuxen Brun-Norge råttor (250-400g) köptes från en kommersiell leverantör och förvarade under en reglerad (12/12) ljus / mörker-cykel. Anestesi var inducerad med en intraperitoneal injektion av ketamin hydroklorid och xylazin (70 och 2 mg / kg respektive Henry Schein Inc) och upprätthålls under hela den expertisiment med en intravenös infusion av ketamin och xylazin (30 och 1 mg / kg / timme) blandat med dextros, salt, och gallamine triethiodide (40 mg / kg / timme, Fischer Inc) genom en kateter (0,13 OD, små delar Inc ) i höger lårbenshals ven. Gallamine ingår i blandningen att förlama ögonrörelser. Infusionshastigheten för pumpen (WPI Inc) har justerats för att bibehålla en stabil plan av anestesi enligt bedömning av hjärtfrekvens och blodtryck variabilitet. Efter förlamning, var djuret mekaniskt ventilerade (Harvard Apparatur, modell 683) genom ett luftrör kanyl på 60-80 andetag / min (2CC volym), med en ränta justeras vid behov för att bibehålla ET-CO ₂ mäts med en in-line capnometer (Novametrix Inc, Modell 710Sp) på 30%. Kroppstemperatur reglerades via en homeothermic filt styrsystem (Harvard Apparatus Inc). Kroppstemperatur, ET-CO _2, hjärtfrekvens och blodtryck var kontinuerligt övervakas under hela experimentet genom en LABVIEW program. Visuella stimuli presenterades på en Sony multiscan 17e CRT-skärm (medelvärde ljusstyrka på 30 cd / m ²⁾ som körs vid 100 Hz med en upplösning på 800x600 pixlar. Datainsamling och monitorutgång kontrollerades med anpassad mjukvara skriven i Matlab och LabView i samband med en video bildprocessor (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) och psykofysik Toolbox ^4. Djuret visade den stimulans display (40,4 x 30,2 cm) på ett avstånd av 16,5 cm med kontaktlinser (Ocular Instrument Inc) och ögondroppar tillämpades periodvis under experimentet för att hålla ögonen fuktiga. Synfältet tillgänglig för stimulering var maximerad genom omvänd montering djuret i en stereotaxic apparat (Stoelting Co) förhöjd 14cm ovanför en flytande tabell (TMC Inc) och ställa bildskärmen på ett skräddarsytt skoter som gått på bordet tillsammans en ± 100 ° båge över näsan. Detta gav en flyttbar skärm område som sträckte sig 60-grader över och 35-grader under ögonhöjd och ± 42-grader i sidled från centrum av skärmen. Tungsten electodes var fabricerade med tråd från små delar Inc och anpassade borosilikatglas från Friedrich och Dimmock Inc. En standard micropippete avdragare (Sutter Instrument, Modell P-97) användes för att forma glaset spetsen. Elektroden impedans testaren köptes från Bak-Electronics. Elektroder avancerad med en motordriven Microdrive system (Newport Inc, StepperMike). EKG och optiska signaler nerv var förstärks och filtreras med en hög ingångsimpedans multielectrode förstärkare (FHC Inc, X-Cell 3x4). Hjärtat slår upptäcktes med ett fönster diskriminator (WPI Inc, modell 121). Nerve aktionspotentialer upptäcktes och tid som stämplats med 0.1ms upplösning av en digital spik diskriminator (FHC Inc, APM). Spetsen diskriminatorn var gated av en trigger signal från videon bildprocessorn så att spika tiderna var låsta till stimulans.

Discussion

Optisk fiber inspelningar är en attraktiv metod för att hantera experimentella frågor om retinal information om kodning och överföring som kräver ett intakt öga. Dessutom kan signalering egenskaper båda ögonen att studeras i stort sett samma fysiologiska tillstånd om elektroden är placerad i synnerven chiasm eller tarmkanalen där aktiviteten av korsade och uncrossed synnerven fibrer kan registreras med en enda elektrod penetration. Optisk fiber inspelningar är vanliga i katten, men inte på andra populära djur modeller som används i en syn forskning, som gnagare, kanske på grund av sin ringa storlek. Vi har provat olika kommersiella elektroder av liknande impedans och material, varav ingen var framgångsrika på att plocka upp enda fiber aktivitet hos råtta, än mindre spela den i flera timmar som våra elektroder kan. Detta innebär att särskilda geometri våra elektroder, som har en lång, vass spets i motsats till den breda trubbiga spetsen av typiska kommersiella sådana, är viktigt för säker och stabil isolering av Axon gangliecell spik tåg. Förutom att visa hur man kan tillverka dessa elektroder, illustrerar vi våra skräddarsydda stereotaxic system för in vivo-visuella neurofysiologiska forskning. Systemet är konstruerat för att skydda den höga impedans mikroelektrod från miljö vibrationer och från elektromagnetiska störningar. Detta är avgörande för att registrera de små aktionspotentialen producerad av axoner (jämfört med cell-organ) under en längre tid, speciellt med en datorskärm placerad i närheten. Det gör det med exceptionell stabilitet och signal-brus-förhållande, med typiska inspelningstider för en timme eller mer och ljudnivåer i storleksordningen tiotals mikrovolt. Dessa funktioner gör installationen särskilt användbart för visionen forskare som syftar till att spela in vivo från nervtrådar i näthinnan eller andra områden i hjärnan.