وحدة واحدة في الجسم الحي تسجيلات من chiasm البصرية من الجرذ

Summary

خلايا الشبكية العقدة نقل المعلومات البصرية من العين إلى الدماغ مع سلاسل من إمكانات العمل. هنا ، ونحن لشرح كيفية تسجيل إمكانات عمل خلايا العقدة واحد

Abstract

تبث المعلومات حول العالم البصرية إلى الدماغ في متواليات من إمكانات العمل في محاور الخلايا الشبكية العقدة التي تشكل العصب البصري.

Protocol

الجزء الأول : تلفيق التنغستن في زجاج كهربائي

1. يتم وضع خاتم الجرافيت في كوب مليئة محلول نترات الصوديوم (0.71g/mL) وهيدروكسيد البوتاسيوم (0.34g/mL) الذائب في الماء ¹ ، ويوضع الدورق تحت الذراع الخياطة آلة الخياطة تعديل .
2. غير مسجلة سلك التنغستن (0.5mm قطرها ، وطول 6cm) إلى ذراع الخياطة بحيث يتم مغمورة جزئيا (1 - 2cm) في الحل.
3. يتم تطبيق 2V عبر السلك التنغستن عن طريق ربط قيادة إيجابية لذراع الخياطة ويؤدي الى حلقة سلبية الجرافيت.
4. وتحولت ماكينة الخياطة على وانخفض سلك التنغستن متكررة الى حل بمعدل ~ 4Hz لمدة 2 دقيقة ، والذي يحفر المعدن الكهربائي إلى نقطة حادة.
5. يتم وضع سلك محفورا على micromanipulator دليل ونقطة محاذاة بتوجيه المجهرية (التكبير 40X) مع رمح ماصة الزجاج (OD 0.25mm ، 0.175mm ID) انسحبت إلى الطرف 1MM مجتذب مع الزجاج. لمنع الحركة خلال الإدراج الأسلاك ، ويتم تأمين مؤقتا الزجاج إلى مرحلة المجهر مع المعجون.
6. متقدمة بعناية السلك في نهاية unpulled من الزجاج ، وأسفل العمود ، ومن خلال افتتاح 1μm يعتبر قطعة صغيرة من الزجاج الى قطع رأس في شريط الفيديو ، مما يدل على أن تناسب ضيق من التنغستن في الزجاج. وينبغي أن تمتد حول السلك 10MM - 5 بعد تلميح للحصول على تسجيلات الفئران الألياف البصرية.
7. يتم تطبيق Cyanoacrylate إلى نهاية unpulled من الزجاج وبعد تصلب يتم قياس المعاوقة الكهربائية ، حيث الأقطاب 1MΩ العمل عموما أفضل.

الجزء الثاني : إعداد التجسيمي وتسجيلات قطار سبايك

1. ويتضح من نظام عرض الحوافز في شريط الفيديو ، جنبا إلى جنب مع الأجهزة والتجسيمي microdrive لتحديد المواقع وخفض الكهربائي في الدماغ.
2. لأداء الشبكية التسجيلات قطار ارتفاع الفأر هو تخدير ومشلولا في وقت لاحق. وتستخدم الإجراءات الموحدة (غير موضح) عن الإدراج الجراحية للقنية الوريد الفخذي لتسليم المخدرات والقصبة الهوائية (Y - أنبوب) قنية للتهوية الميكانيكية خلال الشلل. التجارب هي محطة للحيوان.
3. بعد الإجراءات التحضيرية ، يتم وضع الحيوان على بطانية والتدفئة هو ثابت في موقف رئيس التجسيمي ، حسب تعريف الدماغ الفئران الأطلس ² ، مع الأذن والحانات الأسنان.
4. يتم إدراج التحقيق المستقيم ، الذي يسيطر على بطانية التدفئة عن طريق وحدة تحكم homeothermic التي تحافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
5. إبرة معدنية تستخدم كما يؤدي إلى قياس ورصد الكهربائي معدل ضربات القلب.
6. يتم فتح الجلد في أعلى الجمجمة وتقاطع لوحات الجمجمة (bregma) التي تعرضت هي. ومن المقرر أن الإطار العارضة مصمم خصيصا في المكان ، وضعت دائرة على الجمجمة حول بلغم من خلال ثقب في العارضة ، وتتم إزالة مؤقتا العارضة.
7. ومعايرة نظام التجسيمي عن طريق وضع إبرة دليل على bregma. ومن حفر حفرة 5 ملم في الجمجمة في مكان ملحوظ ، وإزالة العظام ، وتعريض الدماغ. يتم وضع خاتم رقيقة من المعجون حول فتحة في الجمجمة على شكل خاتم حول الثقب في العارضة ، والتي تتم إعادة تعيين في مكانها.
8. إذا كان هذا الحيوان كان في الطائرة مستقرة للتخدير لحظة ، ويتم حقن مع مشلول من أجل منع حركات العين أثناء جمع البيانات. بعد توقف التنفس والتهوية ميكانيكيا الحيوان. برنامج مخصص مسارات التهوية والفسيولوجية المعلمات في كافة مراحل التجربة ويبلغ المجرب إذا لا بد من العمل التعويضي ينبغي لأي المعلمات إلى خارج المستويات العادية.
9. هو دليل backloaded الإبرة مع التنغستن القطب وخفضت الى الدماغ. بعد اختراق الدماغ هو ملء الحفرة العارضة مع آغار (لا يظهر) ، وفرضت الجمعية microdrive الى العارضة لتحقيق الاستقرار الميكانيكية. التنغستن القطب ومن ثم المتقدمة ببطء (2μm/sec) من الإبرة حتى دليل غيض حوالي 9MM - 8 أسفل الجمجمة ، حيث يقع chiasm البصرية.
10. ويتم تحديد ارتفاع القطارات المنتمين إلى خلايا الشبكية العقدة التي استجابتها للمدخلات البصرية. على العزلة من الألياف البصرية واحد هو تعيين الحقل تقبلا للخلية سجلت في الفضاء البصري وتتميز خصائص ردها الانجراف مع حواجز شبكية بصرية أو أنماط أخرى من الفائدة. استقرار النظام يسمح لاحد وحدة تسجيلات لعدة ساعات ^3.

المواد

تم شراؤها الكبار براون النرويج الفئران (250 400g) من بائع التجارية ويضم تحت دائرة الضوء تنظيم / الظلام (12/12). وكان المستحث مع حقنة تخدير داخل الصفاق من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين (70 و 2 ملغم / كغم ، على التوالي ، هنري شين المؤتمر الوطني العراقي) ويحتفظ به لمدة experiment مع التسريب في الوريد من الكيتامين وزيلازين (30 و 1 ملغم / كغم / ساعة) مختلطة مع سكر العنب ، المالحة ، وغالامين triethiodide (40 مغ / كغ / ساعة ، شركة فيشر) عن طريق قسطرة (0.13mm OD ، قطع غيار شركة الصغيرة ) في الوريد الفخذي الأيمن. يتم تضمين غالامين في الخليط إلى شل حركة العين. وتم تعديل معدل ضخ المضخة (WPI المؤتمر الوطني العراقي) حسب الحاجة للحفاظ على استقرار الطائرة التخدير النحو الذي تقدره معدل ضربات القلب وضغط الدم تقلب. بعد الشلل ، والتهوية ميكانيكيا الحيوانية (جهاز هارفارد ، الموديل 683) من خلال القصبة الهوائية قنية في الأنفاس 60-80 / دقيقة (2cc الحجم) ، مع معدل تعديلها عند الضرورة للحفاظ على نهاية المد CO ₂ مع قياس خط داخل capnometer (Novametrix المؤتمر الوطني العراقي ، 710Sp النموذجي) ب 30 ٪. وينظم درجة حرارة الجسم عن طريق نظام مراقبة شامل homeothermic (هارفارد جهاز المؤتمر الوطني العراقي). وتم رصد مستمر درجة حرارة الجسم ، في نهاية المد معدل ضربات القلب CO ₂ ، وارتفاع ضغط الدم في كافة مراحل التجربة من قبل برنامج LABVIEW. وقدمت محفزات بصرية على شاشة CRT Multiscan سوني 17e (يعني الإنارة من 30 شمعة / م ²⁾ على التوالي في 100 هرتز مع قرار من 800x600 بكسل. وكانت تسيطر عليها الحصول على البيانات ومراقبة الانتاج مع برامج مخصصة مكتوبة في Matlab LABVIEW وبالتزامن مع الفيديو معالج الصور (كامبريدج لأبحاث سيستمز ، بتات + +) وأدوات علم النفس البدني ^4. ينظر الحيوان عرض الحوافز (40.4 X 30.2 سم) على مسافة 16.5cm من خلال العدسات اللاصقة (العين الآلات المؤتمر الوطني العراقي) ، وطبق حل العيون بشكل دوري خلال التجربة أن يبقي عينيه رطبة. وكان مكبر المجال البصري للوصول إلى التحفيز عن طريق عكس تركيب الحيوان في جهاز التجسيمي (Stoelting المشارك) 14cm مرتفعة فوق سطح طاولة عائمة (TMC المؤتمر الوطني العراقي) ، ووضع مراقبة على زلاجات مخصص التصميم التي تحركت على طول الطاولة Â ± القوس حوالي 100 درجة الأنف. قدم هذا العرض حقل repositionable التي امتدت 60 درجة وفوق 35 درجة تحت مستوى العين و± 42 درجة أفقيا من مركز مراقبة. ملفقة electodes التنغستن بالأسلاك الحصول على قطع غيار من شركة صغيرة والعرف البورسليكات الزجاج تم الحصول عليها من شركة فريدريش وDimmock A micropippete القياسية مجتذب (سوتر الآلات ، الموديل P - 97) كانت تستخدم لتشكيل طرف زجاج. تم شراؤها من اختبار مقاومة القطب باك للإلكترونيات. كانت متقدمة مع أقطاب النظام microdrive بمحركات (نيوبورت المؤتمر الوطني العراقي ، StepperMike). وتضخمت الكهربائي وإشارات العصب البصري وتصفيتها مع مكبر للصوت مدخلات عالية multielectrode مقاومة (FHC المؤتمر الوطني العراقي ، X - خلية 3x4). تم الكشف عن دقات القلب مع الممي النافذة (WPI المؤتمر الوطني العراقي ، الموديل 121). تم الكشف عن إمكانات عمل العصب وختمها الوقت مع قرار 0.1ms بواسطة الممي الارتفاع الرقمي (FHC المؤتمر الوطني العراقي ، APM). كان ارتفاع الممي بوابات بواسطة إشارة الزناد من الفيديو صورة المعالج بحيث تم تأمين أوقات تصاعد إلى التحفيز.

Discussion

تسجيلات الألياف البصرية هي مقاربة جذابة لمعالجة مسائل تجريبية حول ترميز المعلومات الشبكية ، والتي تتطلب انتقال العين سليمة. وعلاوة على ذلك ، يمكن دراسة خصائص الإشارات من كلتا العينين في حالة فسيولوجية تقريبا نفس إذا تم وضع قطب كهربائي في chiasm البصرية أو المسالك التي يمكن تسجيلها على نشاط وعبرت uncrossed ألياف العصب البصري مع القطب اختراق واحد. تسجيلات الألياف البصرية شائعة في القطط ولكن ليس في غيرها من النماذج الشعبية الحيوانات المستخدمة في الأبحاث الرؤية ، مثل القوارض ، وربما كان ذلك بسبب صغر حجمها. حاولنا مجموعة من الأقطاب الكهربائية التجارية للمقاومة مماثلة والمادية ، أي من التي كانت ناجحة في التقاط واحدة من الألياف النشاط في الفئران ، ناهيك عن تسجيله لعدة ساعات لدينا مثل الأقطاب يمكن. هذا يعني أن هندسة خاصة من الأقطاب الكهربائية لدينا ، والتي لها فترة طويلة ، غيض حاد في مقابل ترجيح كفة كليلة واسعة من تلك تجارية نموذجية ، من المهم للعزلة موثوقة ومستقرة من القطارات خلية العقدة ارتفاع محور عصبي. بالإضافة إلى عرض كيفية تلفيق هذه الأقطاب ، ونحن لدينا تصور نظام مصمم خصيصا لالتجسيمي في الأبحاث المجراة العصبية البصرية. يتم إنشاء نظام لحماية microelectrode مقاومة عالية من الاهتزاز والبيئية من الضجيج الكهرومغناطيسي. هذا أمر بالغ الأهمية لتسجيل وإمكانات العمل الصغيرة التي تنتجها المحاوير (بالمقارنة مع الهيئات الخلية) لفترة طويلة من الزمن ، خصوصا مع جهاز الكمبيوتر وضعه في مكان قريب. وهو يفعل ذلك مع الاستقرار الاستثنائي ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ، مع أوقات نموذجية لتسجيل ساعة أو أكثر ، ومستويات الضوضاء بناء على أمر من عشرات microvolts. هذه الميزات تجعل من إعداد مفيدة بشكل خاص للباحثين رؤية تهدف لتسجيل في الجسم الحي من الألياف العصبية في الشبكية أو مناطق أخرى من الدماغ.