Single-Einheit In-vivo- Aufnahmen aus dem Chiasma der Rat

Summary

Retinalen Ganglienzellen übertragen visuelle Informationen vom Auge an das Gehirn mit Sequenzen der Aktionspotentiale. Hier zeigen wir, wie man die Aktionspotentiale einzelner Ganglienzellen Rekord

Abstract

Informationen über die visuelle Welt ist, das Gehirn in Sequenzen von Aktionspotentialen in retinalen Ganglienzellen Axone, die den Sehnerv übertragen.

Protocol

Teil I: Herstellung von Tungsten-in-Glas-Elektroden

1. Ein Graphit-Ring wird in ein Becherglas mit einer konzentrierten Lösung von Natriumnitrat (0.71g/mL) und Kaliumhydroxid (0.34g/mL) in Wasser ¹ gelöst gefüllten, und der Becher unter dem Näharm einer modifizierten Nähmaschine gelegt .
2. Tungsten Draht (Durchmesser 0,5 mm, 6 cm Länge) ist es, die Näharm, so dass es teilweise eingetaucht ist (1-2cm) in Lösung aufgezeichnet.
3. 2V sind über die Wolfram-Draht durch die Anbringung eines Pluspol an die Näh-Arm und ein Minuspol an die Graphit-Ring angewendet.
4. Die Nähmaschine ist eingeschaltet und der Wolfram-Draht wird wiederholt in die Lösung mit einer Rate von ~ 4Hz für 2 min, die elektrolytisch ätzt das Metall zu einer scharfen Spitze eingetaucht.
5. Die geätzten Draht wird auf eine manuelle Mikromanipulator und an der Stelle unter mikroskopischer Führung (40x Vergrößerung) mit der Welle eines Glaspipette (0,25 mm OD, 0.175mm ID) gezogen, um eine 1mm-Spitze mit einem Glas puller ausgerichtet ist. Um zu verhindern, Bewegung während Draht Einführen wird das Glas vorübergehend auf dem Mikroskoptisch mit Kitt befestigt.
6. Der Draht wird vorsichtig in den unpulled Ende des Glases fortgeschritten, in den Schacht, und durch die 1 &mgr; Öffnung Ein kleines Stück Glas gesehen brechen Sie die Spitze in dem Video, was auf einen festen Sitz der Wolfram in das Glas. Der Draht sollte etwa 5-10mm über die Spitze für Ratten LWL-Aufnahmen zu erweitern.
7. Cyanacrylat ist es, die unpulled Ende des Glases aufgetragen und nach dem Aushärten die elektrische Impedanz wird gemessen, wo 1MΩ Elektroden in der Regel am besten funktionieren.

Teil II: Stereotaktische Setup und Spike Zug Recordings

1. Der Stimulus-Display-System ist in dem Video dargestellt, zusammen mit den stereotaktischen Apparat und Microdrive für die Positionierung und die Senkung der Elektrode in das Gehirn.
2. Zur Durchführung der Netzhaut spike Zug Aufnahmen der Ratte wird betäubt und später gelähmt. Standard-Verfahren (nicht dargestellt) für die chirurgische Insertion eines femoralis Kanüle für Drug-Delivery und eine tracheale (Y-Rohr) Kanüle zur mechanischen Beatmung während der Lähmung eingesetzt. Die Experimente sind Terminals für das Tier.
3. Nach vorbereitenden Verfahren wird das Tier auf der Heizdecke gelegt und der Kopf ist in stereotaktische Position fixiert, wie von Rattenhirn atlas ² definiert, mit Ohr und Zahn Bars.
4. Die rektale Sonde eingesetzt wird, steuert die Heizdecke über eine homeothermic Steuergerät, das die Körpertemperatur hält bei 37 ° C.
5. Metall-Nadel verwendet werden, wie führt zu dem Elektrokardiogramm und überwachen die Herzfrequenz zu messen.
6. Die Haut ist auf der Oberseite des Schädels geöffnet und der Schnittpunkt der Schädel-Platten (Bregma) ausgesetzt ist. Ein speziell konstruiertes Gestell Querlatte anstelle gesetzt ist, wird ein Kreis auf dem Schädel um begma durch ein Loch in die Querlatte markiert, und die Latte ist vorübergehend entfernt.
7. Die stereotaktischen Systems wird durch die Positionierung der Führungsnadel über Bregma kalibriert. Ein 5-mm-Loch in den Schädel an der markierten Stelle gebohrt und der Knochen wird entfernt, so dass das Gehirn. Ein dünner Ring von Kitt ist rund um die Öffnung im Schädel platziert, um eine Dichtung um das Loch in der Latte, die zurückgesetzt wird in Stelle zu bilden.
8. Wenn das Tier auf einem stabilen Ebene der Narkose für eine Weile ist es mit Gelähmten injiziert, um Augenbewegungen während der Datenerfassung zu verhindern. Nach Atemstillstand das Tier mechanisch belüftet ist. Ein benutzerdefiniertes Programm Tracks Lüftungs-und physiologischen Parameter während des gesamten Experiments und informiert den Experimentator, wenn kompensatorische Maßnahmen sind erforderlich, sollten alle Parameter außerhalb der normalen Niveaus zu gehen.
9. Die Führungsnadel ist mit dem Wolfram-Elektrode Backloaded und senkte in das Gehirn. Nach Hirnpenetration die Querlatte Loch ist mit Agar (nicht dargestellt) gefüllt, und das Microdrive Montage ist die Latte für die mechanische Stabilität geklemmt. Die Wolfram-Elektrode wird dann langsam fortgeschritten (2μm/sec) die Führungsnadel, bis die Spitze ist ca. 8-9mm unterhalb der Schädelbasis, wo das Chiasma befindet.
10. Spike Züge gehören retinalen Ganglienzellen durch ihre Reaktion auf visuellen Input identifiziert. Nach Isolierung eines einzigen Lichtwellenleiter das rezeptive Feld der aufgenommenen Zelle ist in visuellen Raum kartiert und ihre Reaktion Eigenschaften sind mit treibenden Gitter oder andere visuelle Muster von Interesse geprägt. Die Stabilität des Systems ermöglicht eine Single-Unit-Aufnahmen von mehreren Stunden ^3.

Materialien

Adult Brown-Norway Ratten (250-400g) wurden von einem kommerziellen Anbieter erworben und beherbergt unter einem geregelten (12/12) Hell / Dunkel-Zyklus. Die Narkose wurde mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Hydrochlorid und Xylazin (70 und 2 mg / kg bzw. Henry Schein Inc.) induziert und aufrecht erhalten für die Dauer des experiment mit einer intravenösen Infusion von Ketamin und Xylazin (30 und 1 mg / kg / h) mit Dextrose, Salz vermischt und gallamine triethiodide (40 mg / kg / h, Fischer Inc) durch einen Katheter (0,13 mm OD, Small Parts Inc ) in die rechte Vena femoralis. Gallamine wird in der Mischung, um Augenbewegungen zu lähmen enthalten. Die Infusion der Pumpe (WPI Inc) eingestellt wurde, wie notwendig, um eine stabile Ebene der Narkose zu halten, wie Herzfrequenz und Blutdruck Variabilität beurteilt. Nach Lähmung, war das Tier mechanisch beatmet (Harvard Apparatus, Model 683) durch eine Trachealkanüle bei 60-80 Atemzüge / min (2cc Volumen), wobei die Rate bei Bedarf angepasst werden, um zu halten endexspiratorischen CO ₂ mit einem in-line gemessen Kapnometer (Novametrix Inc, Model 710Sp) bei 30%. Die Körpertemperatur wurde über eine homeothermic Decke Steuerung (Harvard Apparatus Inc) geregelt. Körpertemperatur, endexspiratorischen CO _2, Herzfrequenz und Blutdruck wurden kontinuierlich während des gesamten Versuchs von einem LabVIEW-Programm überwacht. Visuelle Reize wurden auf einem Sony Multiscan 17e CRT-Monitor (mittlere Leuchtdichte von 30 cd / m ²⁾ mit 100 Hz mit einer Auflösung von 800x600 Pixel dargestellt. Datenerfassung und-Monitor-Ausgang wurden mit kundenspezifischer Software in Matlab und LabView in Verbindung mit einem Video-Bild-Prozessor (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) und die Psychophysik Toolbox ⁴ geschrieben wurde. Das Tier sah den Reiz Display (40,4 x 30,2 cm) in einem Abstand von 16,5 cm durch Kontaktlinsen (Ocular Instruments Inc) und Augentropfen wurde periodisch während des Experiments zu halten die Augen feucht angewendet. Das Gesichtsfeld zugänglich Stimulation wurde durch reverse Montage des Tieres in einem stereotaktischen Apparat (Stölting Co) erhöhten 14cm über der Oberfläche eines schwebenden Tisch (TMC Inc) und die Einstellung des Monitors auf einem speziell entwickelten Schlitten, auf dem Tisch entlang bewegt maximiert von ± 100 Grad Bogen um die Nase. Dies ergab ein repositionierbar Anzeigefeld, dass 60-Grad oberhalb und 35-Grad unterhalb der Augenhöhe und ± 42-Grad seitlich von der Mitte des Monitors erweitert. Tungsten electodes wurden mit Draht von Small Parts Inc und benutzerdefinierte Borosilikatglas von Friedrich und Dimmock Inc. Ein Standard micropippete Puller (Sutter Instruments, Modell P-97) erhalten wurde hergestellt wurde benutzt, um das Glas Tip Shape. Die Elektrodenimpedanz-Tester wurde von Bak-Electronics gekauft. Die Elektroden wurden mit einem motorisierten Microdrive-System (Newport Inc, StepperMike) fortgeschritten. Elektrokardiogramm und Sehnerv Signale wurden verstärkt und mit einer hohen Eingangsimpedanz Multielektroden Verstärker (FHC Inc, X-Cell 3x4) filtriert. Herzschläge wurden mit einem Fenster-Diskriminator (WPI Inc, Model 121) festgestellt. Nerve Aktionspotentiale wurden erkannt und mit einem Zeitstempel versehen mit 0,1 ms Auflösung von einer digitalen spike Diskriminator (FHC Inc., APM). Die Spike-Diskriminator wurde gated durch ein Trigger-Signal aus dem Video-Bildprozessor, so dass Spike mal auf den Stimulus wurden gesperrt.

Discussion

Glasfaser-Aufnahmen sind ein attraktiver Ansatz für die Bewältigung experimentellen Fragen zu retinalen Informationen Kodierung und Übertragung, die eine intakte Auge erfordern. Darüber hinaus kann die Signalisierung Eigenschaften beider Augen in nahezu der gleichen physiologischen Zustand untersucht werden, wenn die Elektrode in das Chiasma oder Trakt, wo die Aktivität von gekreuzten und ungekreuzten Sehnervenfasern mit einer einzigen Elektrode Eindringen aufgezeichnet werden kann positioniert ist. Glasfaser-Aufnahmen sind in Katze häufig, aber nicht in andere beliebte Tiere Modelle in Sicht der Forschung, wie Nagetiere, vielleicht wegen ihrer geringen Größe. Wir haben eine Vielzahl von kommerziellen Elektroden ähnlich Impedanz und Material, von denen keines erfolgreich Abholung einzelne Faser-Aktivität in Ratten wurden vor Gericht gestellt, geschweige denn die Aufnahme ist für mehrere Stunden wie unsere Elektroden können. Dies bedeutet, dass die besondere Geometrie der Elektroden, die eine lange, scharfe Spitze, um die breite stumpfe Spitze der typischen kommerziellen widersetzt haben, wichtig ist für eine zuverlässige und stabile Isolierung von Ganglienzellen Axon Spike Zügen. Zusätzlich zu zeigen, wie man diese Elektroden herzustellen, zeigen wir Ihnen unsere maßgeschneiderten stereotaktischen Systems zur in-vivo-visuelle neurophysiologischen Forschung. Das System ist so aufgebaut, die mit hoher Impedanz Mikroelektroden aus Umwelt-Vibration und von elektromagnetischen Störungen zu schützen. Dies ist entscheidend für die Aufnahme der kleinen Aktionspotentiale von Axonen (im Gegensatz zu Zellkörper im Vergleich) für einen längeren Zeitraum produziert, vor allem mit einem Computer-Monitor positioniert in der Nähe. Er tut dies mit außergewöhnlicher Stabilität und Signal-Rausch-Verhältnis, mit typischen Aufnahmezeiten von einer Stunde oder mehr und Geräuschpegel in der Größenordnung von einigen zehn Mikrovolt. Diese Eigenschaften machen das Setup besonders nützlich für die Vision Forscher dem Ziel, in vivo aus Nervenfasern der Netzhaut oder andere Hirnregionen aufzunehmen.