Una sola unidad En vivo Grabaciones de la quiasma óptico de la rata

Summary

Las células ganglionares de la retina transmiten la información visual desde el ojo hasta el cerebro con las secuencias de potenciales de acción. En este caso, se demuestra cómo registrar los potenciales de acción de las células ganglionares de la única

Abstract

Información sobre el mundo visual se transmite al cerebro en las secuencias de potenciales de acción en la retina los axones de las células ganglionares que forman el nervio óptico.

Protocol

Parte I: La fabricación de electrodos de tungsteno en vidrio

1. Un anillo de grafito se coloca en un vaso lleno de una solución concentrada de nitrato de sodio (0.71g/mL) e hidróxido de potasio (0.34g/mL) disuelto en agua ^1, y el vaso se coloca debajo del brazo de costura de una máquina de coser modificadas .
2. Alambre de tungsteno (0,5 mm de diámetro de longitud, 6 cm) con cinta adhesiva en el brazo de costura para que está parcialmente sumergido (1-2cm) en la solución.
3. 2V se aplican a través del alambre de tungsteno uniendo un borne positivo en el brazo de costura y un cable negativo al anillo de grafito.
4. La máquina de coser está encendida y el alambre de tungsteno se sumerge repetidamente en la solución a un ritmo de 4 Hz ~ durante 2 minutos, que graba el metal electrolíticamente con una punta afilada.
5. El cable de grabado se coloca en un micromanipulador manual y el punto alineado bajo la dirección de microscópicas (40x) con el eje de una pipeta de vidrio (0,25 mm OD, 0.175mm ID) sacó a un punta de 1mm con un extractor de vidrio. Para evitar el movimiento durante la inserción de cables, el vaso está temporalmente asegurado a la platina del microscopio con masilla.
6. El cable está cuidadosamente avanzada en el extremo unpulled de la copa, por el hueco, ya través de la apertura de 1μm Una pequeña pieza de cristal se ve a romper la punta en el video, lo que indica un buen ajuste del tungsteno en el vaso. El cable debe extenderse alrededor de 5 a 10 mm más allá de la punta para las grabaciones de la rata de fibra óptica.
7. Cianoacrilato se aplica hasta el final unpulled de la copa y tras el endurecimiento de la impedancia eléctrica se mide, donde los electrodos 1MΩ generalmente funcionan mejor.

Parte II: Configuración estereotáxica y grabaciones de Spike tren

1. El sistema de visualización de estímulo se muestra en el video, junto con el aparato estereotáxico y microdrive para el posicionamiento y la reducción de los electrodos en el cerebro.
2. Para llevar a cabo grabaciones de la retina de la rata pico de tren está anestesiado y paralizado posteriormente. Procedimientos estándar (no ilustrado) se utilizan para la inserción quirúrgica de una cánula de la vena femoral para la administración de fármacos y la tráquea (tubo en Y) cánula de ventilación mecánica durante la parálisis. Los experimentos son terminales para el animal.
3. Después de los procedimientos preparatorios, el animal se coloca en la manta de calefacción y la cabeza se fija en su posición estereotáxica, como se define en el cerebro de rata atlas ^2, con el oído y bares de los dientes.
4. La sonda rectal se inserta, que controla la manta de calefacción a través de una unidad de control homeotérmicos que mantiene la temperatura corporal a 37 º C.
5. Aguja de metal se utilizan como pistas para medir el electrocardiograma y el monitor de ritmo cardíaco.
6. La piel se abre en la parte superior del cráneo y de la intersección de las placas del cráneo (bregma) está expuesto. Un marco travesaño de diseño personalizado se encuentra en el lugar, un círculo marcado en el cráneo alrededor de begma a través de un agujero en el travesaño, el travesaño y se retira temporalmente.
7. El sistema estereotáxico se calibra mediante la colocación de la aguja guía en bregma. Un agujero de 5 mm se perfora en el cráneo en el lugar señalado y se retira el hueso, exponer el cerebro. Un delgado anillo de masilla se coloca alrededor de la abertura en el cráneo para formar un sello alrededor del agujero en el travesaño, que se pone en su lugar.
8. Si el animal ha estado en un plano estable de anestesia por un tiempo, se inyecta el medio paralítico con el fin de evitar que los movimientos oculares durante la recolección de datos. Después de la respiración se detiene el animal está con ventilación mecánica. Un programa personalizado pistas de los parámetros de ventilación y fisiológicas durante todo el experimento y el experimentador informa si la acción compensatoria es necesario que los parámetros de salir de los niveles normales.
9. La aguja guía se backloaded con el electrodo de tungsteno y bajó en el cerebro. Después de penetración en el cerebro del agujero que la barra esté llena de agar (no mostrado), y el conjunto de microdrive se fija a la barra transversal de la estabilidad mecánica. El electrodo de tungsteno es lentamente avanzada (2μm/sec) la aguja guía hasta que la punta es de 8 a 9 mm por debajo del cráneo, donde se encuentra el quiasma óptico.
10. Trenes pico perteneciente a las células ganglionares de la retina se identifican por su respuesta a estímulos visuales. Tras el aislamiento de una de fibra óptica el campo receptivo de la célula registrada se asigna en el espacio visual y sus propiedades de respuesta se caracteriza a la deriva con rejillas u otros patrones visuales de interés. La estabilidad del sistema permite la grabación de una sola unidad de varias horas ^3.

Materiales

Adultos de Brown-Noruega ratas (250-400g) fueron comprados de un proveedor comercial y alojados en un mercado regulado (12/12) ciclo luz / oscuridad. La anestesia fue inducida con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina y xilazina (70 y 2 mg / kg, respectivamente, Henry Schein Inc.) y se mantiene durante la duración de la experiment con una infusión intravenosa de ketamina y xilazina (30 y 1 mg / kg / hr) se mezcla con dextrosa, suero fisiológico, y triethiodide galamina (40 mg / kg / hr, Fischer Inc) a través de un catéter (0,13 mm OD, piezas pequeñas Inc ) en la vena femoral derecha. Galamina se incluye en la mezcla para paralizar los movimientos oculares. La velocidad de infusión de la bomba (WPI Inc) se ajustó según sea necesario para mantener un plano estable de anestesia según la evaluación de la frecuencia cardiaca y la variabilidad de la presión arterial. Después de la parálisis, el animal estaba con asistencia respiratoria mecánica (Harvard Apparatus, Modelo 683) a través de una cánula traqueal a 60-80 respiraciones / min (2 cc de volumen), con la tasa de los ajustes necesarios para mantener la final de la espiración de CO ₂ medido con una línea de in- capnómetro (Novametrix Inc, Modelo 710Sp) a 30%. La temperatura corporal se regula a través de un sistema de control de manta homeotermos (Harvard Apparatus Inc). La temperatura del cuerpo, final de la espiración de la frecuencia cardíaca de CO _2, y la presión arterial fueron monitoreadas continuamente durante todo el experimento por un programa de LabVIEW. Los estímulos visuales fueron presentados en un Sony Multiscan 17e monitor CRT (promedio de luminancia de 30 cd / m ²⁾ funcionando a 100 Hz con una resolución de 800x600 píxeles. Adquisición de datos y salida de monitor fueron controlados con software personalizado en Matlab y LabVIEW junto con un procesador de imagen de vídeo (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) y la caja de herramientas Psicofísica ^4. El animal ve la pantalla de estímulo (40,4 x 30,2 cm) a una distancia de 16,5 cm a través de las lentes de contacto (Ocular Inc Instruments), y la solución oftálmica se aplica periódicamente durante el experimento para mantener los ojos húmedos. El campo visual accesible a la estimulación fue maximizado por revertir el montaje del animal en un aparato estereotáxico (Stoelting Co) 14cm elevado por encima de la superficie de una tabla flotante (TMC Inc) y el establecimiento de la pantalla en un trineo de diseño personalizado que se mueve sobre la mesa a lo largo de a ± 100 grados de arco de la nariz. Esto proporcionó un campo de visualización reposicionable que se extendió de 60 grados por encima y 35 grados por debajo del nivel del ojo y de ± 42 grados lateralmente desde el centro del monitor. Electodes tungsteno fueron fabricados con hilos obtenidos a partir de pequeñas piezas Inc y la costumbre de vidrio de borosilicato obtenidos a partir de Friedrich y Dimmock Inc. Una norma micropippete extractor (Sutter Instruments, modelo P-97) se utilizó para dar forma a la punta de vidrio. El probador de impedancia del electrodo fue adquirido de Bak-Electronics. Los electrodos se adelantaron con un sistema motorizado microdrive (Newport Inc, StepperMike). Electrocardiograma y las señales del nervio óptico se amplifica y se filtra con un amplificador de alta impedancia de entrada multielectrodo (FHC Inc, X-Cell 3x4). Latidos del corazón se detectaron con un discriminador de ventana (WPI Inc, Modelo 121). Potenciales de acción del nervio se detectaron y sellado de tiempo con una resolución de 0,1 ms por un discriminador digital de punta (FHC Inc, APM). El discriminador pico fue cerrada por una señal de disparo desde el procesador de imagen de vídeo para que los tiempos de pico estaban cerradas a los estímulos.

Discussion

Grabaciones de fibra óptica es un enfoque atractivo para abordar las cuestiones experimentales sobre la codificación de información de la retina y la transmisión que requieren de un ojo intacto. Por otra parte, las propiedades de señalización de ambos ojos pueden ser estudiados en prácticamente el mismo estado fisiológico, si el electrodo se coloca en el quiasma óptico o el tracto donde se encuentra la actividad de las fibras del nervio óptico cruzados y no cruzados grabado con una penetración del electrodo. Grabaciones de fibra óptica son comunes en los gatos, pero no en otros modelos animales popular en investigación de la visión, tales como roedores, tal vez debido a su pequeño tamaño. Hemos probado una gran variedad de electrodos comerciales de impedancia similar y materiales, ninguno de los cuales tuvieron éxito en recoger la actividad de una sola fibra, en la rata, por no hablar de la grabación durante varias horas como la nuestra puede electrodos. Esto implica que la particular geometría de nuestros electrodos, que tienen una punta larga y afilada en comparación con la punta roma de la gama típica de los comerciales, es importante para el aislamiento fiable y estable de las células ganglionares de los trenes axón pico. Además de mostrar cómo fabricar estos electrodos, ilustramos nuestro diseño personalizado del sistema estereotáxico para la investigación in vivo neurofisiológicos visual. El sistema está construido para proteger los microelectrodos de alta impedancia de vibración ambiental y de ruido electromagnético. Esto es fundamental para el registro de los potenciales de acción producidos por pequeños axones (en comparación con los cuerpos celulares) durante un período prolongado de tiempo, especialmente con un monitor de ordenador situado cerca. Lo hace con una estabilidad excepcional y una relación señal-ruido, con tiempos de grabación típica de una hora o más y los niveles de ruido en el orden de las decenas de microvoltios. Estas características hacen que la configuración especialmente útil para los investigadores de la visión con el objetivo de grabar en vivo a partir de las fibras nerviosas de la retina o en otras regiones del cerebro.