Summary
我们描述了一种通过改变早期的生活后，其在哺乳动物细胞中合成的糖蛋白的N -连接聚糖分析方法。这是通过分析代谢标记聚糖，从糖蛋白和高效液相色谱法检查酶的释放脉冲追逐。
Abstract
扣押的GLC
Protocol
以下协议的目的是为分析总糖蛋白或利益的特定糖蛋白的糖链。这个过程基本上是与整个协议内的几个改变这两种情况下相同。
- 对于N -连接聚糖代谢的标签需要使用哺乳动物细胞生长在一个90毫米，每个样品菜过夜subconfluent的文化（样本可能代表不同的时间点或治疗）。此协议是NIH 3T3细胞进行了优化。
- 饿死孵育5毫升新鲜配制的预热（37℃）葡萄糖的培养基，提供10％的透析FCS和丙酮酸钠4毫米为5-15分钟，对葡萄糖的细胞。
- 饥饿介质更换1毫升预热（37 ° C）葡萄糖免费培养基中含有400μCi[2 - 3 H] -标记的甘露糖（低浓度65μCi/ ml的总糖蛋白标签），孵育的细胞在正常组织培养条件下，1小时。
- 从每个样品中取出的标签介质，并仔细添加2毫升的PBS在4 ° C到相应的脉冲，并放置在冰（这些样本简称为脉冲）的样品，而追逐相应的样品需要漂洗3次，用2 ml预热（37 ° C）正常完整的培养液中，然后放置在CO 2培养箱在37 ° C预热所需的追逐期间的常规培养基用5毫升。
- 2毫升冰冷的PBS冲洗脉冲样本（以前置于冰上）的3倍。细胞，然后刮掉在2毫升PBS盘使用细胞刮刀，并放置到2 mL Eppendorf管。
- 短自旋16000Xg（6-10秒）的细胞，弃去上清液，并冻结细胞沉淀于-80 ° C。
- 执行步骤5和6在追逐时间结束的追逐样品。
- 从冰箱中取出的细胞和300缓冲液溶解，涡旋简要孵化冰20分钟，或在分析总糖蛋白的情况下孵育缓冲液B冰20分钟，其次是超声（4次，10秒，最大振幅），再煮沸5分钟的样品。
- 在16000Xg离心的细胞裂解液，在4 ° C 20分钟将上清转移至一个新的Eppendorf管中，弃去沉淀。
- 如果分析总糖蛋白，进行分子过滤和deglycosylation（17步）。对于这里的H2A糖蛋白的免疫证明，添加20l/sample（Repligen）蛋白A -琼脂糖珠1:1暂停和3μL/兔抗H2A所需的糖蛋白抗体的样本（在我们的例子反H2A抗体），从第9步上清。
- 样品在4 ° C孵育4-16小时，不断缓慢旋转混合。
- 30秒，在16000Xg离心珠，小心取出上清液用真空。
- 珠洗净，加入500μL缓冲液D和震荡。旋在第12步，去除上清。重复洗3次。
- 新增加入10μl变性缓冲液（NEB远藤- H的套件提供）珠沉淀，煮沸5分钟（总蛋白分析时，deglycosylation上进行过滤器的单片机，第17步）的样品。
- 离心珠（16000Xg 30秒），并转移到一个新的Eppendorf管中的上清液。远藤H酶0.5μL加入到每个样品10μL的反应缓冲液（与NEB远藤H套件还提供），样品在37 ° C为3小时。
- 要单独释放的蛋白质聚糖，样品用去离子水稀释5倍，并放置一个分子过滤器（单片机Ultracel YM30）上，用一个30kDa截止3分钟，然后在14000Xg离心。应用去离子水，并重复离心样品50μL。这冲洗，重复2次以上，保持流过。
- 如果要分析总糖蛋白，适用于单片机过滤的细胞裂解液上清（从第9步）。提取液与100μL缓冲区E，3次重复14000Xg离心3分钟清洗。加入3μL10X远藤H的反应缓冲液和1.5μL远藤H酶单片机截留，孵育3小时37 ° C。 3反复离心发布聚糖与去离子水洗脱，在第16步。
- 如果需要的话，retentates步骤16和17，含有抗远藤的H -糖蛋白的N -糖苷酶F 200亩，然后孵育15μL缓冲液C，37 ° 16小时彗星用去离子水洗脱是在第16步完成。
- 将管中，在SpeedVac浓缩流过的远藤H的反应（步骤16和17），干燥完全的样品（这是可以做到高达45 ° C至加速这一进程）。
- 要准备的高效液相色谱法样品，重悬在12μL的HPLC溶剂（乙腈：水，60:40，1％磷酸）的干燥颗粒。
- HPLC设备（连接到Spherisorb列）来调整流量恒定的溶剂（1毫升/分钟）和压力（1000和2000 psi之间的一个特定值），并放置一小部分收集器，以改变管每隔1分钟。
- 装入样品的HPLC设备，并同时启动馏分收集。
- 收集从每个样品运行，并从一个标准的低聚糖混合物运行的48 1毫升的分数。
- 从每个几分闪烁瓶，转移500μL和3毫升水混合闪烁液混合使用的内容。
- 装入小瓶和闪烁计数器中读取。
- CPM的读数绘制成的一小部分数量的函数。
- 在高峰期的CPM值代表一个具体聚糖物种如下：分数18-21对应M5的22日至26日到M6，分数，分数27-31 M7的，分数32-35 M8的36-39以M9的，分数，分数40-42 G1M9和分数43-45 G2M9。
- cpm值在每个峰的分数的总和，体现了一个具体聚糖品种的绝对量。为了弥补物种中含有较多的甘露糖残基的事实，获取更多的标签，每个聚糖物种“相对摩尔量”计算公式如下：每个聚糖物种的绝对量是由甘露糖残基的数目，它包含。然后将这个值除以获得每个具体聚糖品种获得“总数的百分之”的所有聚糖物种的相对摩尔金额的总和。
| 大通（H） | 0 | 4 |
| 发表远藤H（CPM） 一个 | 90000 | 16800 |
| 发布的N -糖苷酶F（CPM）B | 20400 | 3900 |
| 糖蛋白在截留（CPM）C | 371700 | 127695 |
| Dolichol寡糖截留（CPM）D | 4350 | 540 |
| 截留Dolichol低聚糖（％）Ë | 1.4 ± 0.7 | 0.2 ± 0.2 |
表1分析deglycosidases和N -连接的糖蛋白样品dolichol寡糖的存在的糖链的释放。
NIH 3T3细胞裂解液从我们应用脉冲追逐过程。单片机过滤后，标记的N -连接寡糖主要发布与远藤H脉冲标记后（高甘露糖型）和进一步治疗的N -糖苷酶F追逐期后，将对应的复杂类型（高尔基体加工多聚糖），远藤H耐低聚糖。这种定量分析确定，dolichol寡糖，占微不足道的一小部分的标签在初始截留。
注：
- 脉冲[2 - 3 H]标记的甘露糖和NIH 3T3细胞完全培养基追。孵育细胞裂解和过滤通过单片机YM30后，被释放的高甘露糖N -连接寡糖与远藤H.从retentates
- 远藤抗H -（一）单片机retentates的材料，然后培养的N -糖苷酶F，并公布在闪烁计数器测量的低聚糖。
- 单片机retentates获得（一）远藤H处理前，用氯仿提取4次：甲醇：水10点10分03秒，以消除易制毒化学糖脂，unextracted材料1N NaOH溶液溶解，并在闪烁计数器计数。
- Dolichol寡糖纯化提取物（三）所述的闪烁计数器计数。
- 平均3％dolichol寡糖总截留CPM（D）实验（C + D）。
代表性的成果
图1。 1h后的脉冲追逐总NIH在未经处理的细胞，并经蛋白酶抑制3T3糖蛋白分析与脉冲标签。[2 - 3 H]，我们取得了一些glucosylated预期的个人资料余下的前体（GLC 2人9 2（G2M9）葡萄糖和G1M9），但大部分标签在M9和M8种，后者是修剪所有的葡萄糖和甘露糖残基（图1）的结果。没有自由的甘露糖或其他小前体进行了检测，证明彻底的净化。经过一个相当长的8H追逐有更广泛的修整M7 - 6和少量的M5，但主要品种继续M9和M8（图一B）。如果追一个蛋白酶抑制剂（30微米MG - 132）的存在，只是有轻微的修剪这些相同的物种积累（图1 C）。
图2。相比，总糖蛋白糖链的ERAD基板的定量分析 。 （一）在一项实验中类似图1中，每个低聚糖物种的相对摩尔金额计算，甘露糖含量。 （二）我们每个聚糖物种获得的cpm值转换，每个物种，相对的所有物种目前的相对摩尔金额总和的百分比作为追逐的时间平均两个实验的功能，然后绘制。类似到（a）除ERAD基板ASGPR H2A发布的聚糖分析后，到4H脉冲标记和追逐中存在的蛋白酶抑制剂MG - 132的情况下，（C）值4H追逐的存在MG - 132（A）和（B）是比ASGPR H2A和糖蛋白池（四）修剪在ER进程的N -连接糖链的计划。糖修整过程，导致M6 - 5蛋白（R）的，有针对性地对这些相比，M9 - 8 ERAD，出口到高尔基体和超越。结果表明，ERAD的过程是修剪N -糖链的甘露糖产量与剩余的5-6甘露糖残基物种。
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Discussion
HPLC分离的活细胞聚糖的脉冲追逐分析提供了一个学习生活的一种糖蛋白，低聚糖的结构上的改动动态方法。有越来越多的证据表明，这样的改变是在参与生产的信号ER折叠，质量控制和贩运系统 2-5 。不仅对一个特定的糖蛋白的利益，但也总糖蛋白，如本文所示，我们比较一个特定的ERAD基板对比的命运和细胞糖蛋白池的结构动力学分析，该方法可应用于。净化技术是简单但却十分具体。通过使用严格的deglycosidases分子过滤，它是得到保证，只有N -连接糖蛋白释放聚糖，背后人，如O -连接糖链和GPI锚定蛋白等大分子物质[2 - 3 H]标记离开。从dolichol易制毒化学发布的寡糖是微不足道的污染物（见表1）。
该方法提供了高灵敏度的检测，使用极少量的起始材料。期待一个非常低的收益率时，可进一步提高灵敏度，减少使用SpeedVac的HPLC分数量。因此，可以克服的，闪烁液中的溶解度限制和整个分数的内容可以在闪烁计数器监视。
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Acknowledgments
我们感谢Zehavit Frenkel和桑德拉Tolchinsky技术援助。有关这项工作的研究是由以色列科学基金会（1229年至1207年），德国和以色列的项目合作（DIP - DFG）的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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