Summary
Vi beskriver en metod för analys av förändring av N-bundna glykaner genom tidiga liv glykoproteiner efter deras biosyntes i däggdjursceller. Detta uppnås genom att puls-jakt analys av metaboliskt märkt glykaner, enzymatiska frigivning från glykoproteiner och examination genom HPLC.
Abstract
Infästning av Glc
Protocol
Följande protokoll är avsedd för analys av socker kedjor av totalt glykoproteiner eller specifika glykoprotein av intresse. Förfarandet är i grunden densamma i båda fallen med några ändringar som anges hela protokollet.
- För metabola märkning av N-bundna glykaner man behöver använda en subconfluent kultur av däggdjursceller vuxit över natten i ett 90 mm maträtt för varje prov (prov kan representera olika tidpunkter eller behandlingar). Detta protokoll är optimerad för NIH 3T3 celler.
- Svälta cellerna för glukos genom inkubering i 5 ml nyberedd förvärmda (37 ° C) glukos-fri medium, levereras med 10% dialyseras FCS och 4 mm natrium pyruvat i 5-15 minuter.
- Byt svält medium med 1 ml förvärmda (37 ° C) glukos-fri medium som innehåller 400 μCi av [2 - 3 H]-märkt mannos (lägre koncentration av 65 μCi / ml används för märkning av totalt glykoproteiner) och inkubera cellerna i normala förhållanden vävnadsodling i 1 timme.
- Ta bort märkningen mediet från varje prov, och tillsätt försiktigt 2 ml PBS vid 4 ° C för att de prover som motsvarar puls och placera dem på is (dessa prover kallas pulser), medan de prover som motsvarar jakten måste sköljas tre gånger med 2 ml förvärmda (37 ° C) normala komplett odlingsmedium, och sedan placeras i en CO 2-inkubator vid 37 ° C med 5 ml förvärmda regelbundna medium för den önskade jaga perioder.
- Skölj pulsen prover (tidigare släppts ut på is) 3 gånger med 2 ml iskall PBS. Cellerna är sedan skrapas av skålen i 2 ml PBS med hjälp av en cell skrapa, och placeras i en 2 ml Eppendorf-rör.
- Kort-spin cellerna på 16000Xg (6-10 sek), kassera supernatanten och frysa cellpelleten vid -80 ° C.
- Utför steg 5 och 6 också för jakten prov i slutet av jakten tiden.
- Ta bort celler från frysen och Lyse dem genom tillägg av 300 l av buffert A vortexa kort och inkubation under 20 minuter på is, eller i fråga om totala glykoproteiner analys, genom inkubering 20 min på is med buffert B, följt av sonication (4 gånger, 10 sek, maximal amplitud), sedan koka prover för 5min.
- Centrifugera lysates på 16000Xg i 20 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt Eppendorf-rör och kassera pellets.
- Om analysera totalt glykoproteiner, fortsätt till molekylär filtrering och deglycosylation (steg 17). För immunoprecipitation av H2a glykoprotein visat här, lägga 20l/sample av (Repligen) protein A-agaros pärlor 01:01 fjädring och 3 l / urval av våra kanin polyklonala anti H2a antikropp för önskad glykoprotein (i vårt exempel anti-H2a antikropp ), till supernatanten från steg 9.
- Inkubera prov för 4-16 timmar vid 4 ° C, ständigt blandas genom långsam rotation.
- Spinn ner kulorna på 16000Xg i 30 sekunder och ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av vakuum.
- Skölj pärlor, genom att tillsätta 500 l buffert D och vortexa. Spin som i steg 12 och avlägsna supernatanten. Upprepa tvätta 3 gånger.
- Lägg 10μl denatureringen buffert (levereras med de nationella tillsynsorganen endo-H-kit) till pärla pellets och koka prover för 5 min (när totalt proteiner analyseras, är deglycosylation utförs på Microcon filtret, steg 17).
- Spinn ner kulorna (16000Xg i 30 sekunder), och överför supernatanten till en ny Eppendorf-rör. Då 0.5μl av endo H enzym tillsätts varje prov tillsammans med 10 l av reaktionen buffert (levereras även med de nationella tillsynsorganen endo H kit), och proverna inkuberas vid 37 ° C i 3 timmar.
- Att skilja ut glycans från proteiner skall provet spädas 5 gånger med avjoniserat vatten och placeras på toppen av en molekylär filter (Microcon Ultracel YM30), med en 30kDa cut-off, centrifugeras sedan vid 14000Xg i 3 min. Applicera 50μl av avjoniserat vatten och upprepa centrifugering av proverna. Detta wash-out upprepas två gånger till, hålla genomströmning.
- Om du analyserar totalt glykoproteiner, tillämpa supernatanten av lysates (från steg 9) till Microcon filtret. Tvätta extraktet med 100 l av buffert E, 3 gånger av upprepad centrifugering vid 14000Xg i 3 min. Tillsätt 3 l 10X endo H reaktion buffert och 1,5 ìl av endo H enzymet till Microcon retentate och inkubera i 3 timmar vid 37 ° C. De frigjorda glycans elueras med avjoniserat vatten med 3 upprepade centrifugering, som i steg 16.
- Om så önskas, är retentates från steg 16 och 17, innehåller endo H-resistenta glykoproteiner inkuberas sedan med 200mU av N-glycosidase F i 15 ìl buffert C, vid 37 ° C i 16 h. Upplösning med avjoniserat vatten görs som i steg 16.
- Placera röret med endo H reaktion genomströmning (steg 16 och 17) i en SpeedVac anrikningsverkOch torka proverna helt (detta kan göras upp till 45 ° C för att påskynda denna process).
- För att förbereda prover för HPLC, resuspendera torra pellets i 12 ìl av HPLC-lösningsmedel (acetonitril: vatten, 60:40, 1% fosforsyra).
- Justera HPLC enheten (ansluten till Spherisorb kolumnen) till konstant flöde av lösningsmedlet (1 ml / min) och tryck (ett visst värde mellan 1000 och 2000 psi), och placera en bråkdel samlare för att ändra ett rör varje 1 minut.
- Ladda prover i HPLC-enheten och starta Fraktionssamlare samtidigt.
- Samla 48 fraktioner om 1 ml från varje prov köra och från en körning av en standard oligosackarid blandning.
- Överför 500 l från varje fraktion till en scintillation flaskan och blanda innehållet med 3 ml vatten-blandbar scintillation vätska.
- Ladda injektionsflaskor och läste i en scintillationsräknare.
- CPM avläsning ritas som en funktion av fraktion nummer.
- CPM värden inom en topp representerar en specifik glycan arter enligt följande: fraktioner 18-21 motsvarar M5, bråk 22-26 till M6, bråk 27-31 till M7, bråk 32-35 till M8, bråk 36-39 till M9, fraktioner 40-42 till G1M9 och fraktioner 43-45 till G2M9.
- Summan av CPM värden för fraktioner inom varje topp återspeglar den absoluta mängden av en specifik glycan arter. För att kompensera för det faktum att arten innehåller mer mannos rester skaffa mer etikett, den "relativa molära belopp" för varje glycan arter beräknas på följande sätt: den absoluta mängden av varje glycan art delas med antalet mannos rester att det innehåller . Detta värde divideras sedan med summan av de relativa molar mängder av alla glycan arter som erhålls för att få "procent av den totala" för varje specifik glycan arter.
| Chase (h) | 0 | 4 |
| Släppt med Endo H (CPM) en | 90 tusen | 16.800 |
| Släppt med N-glycosidase F (CPM) b | 20.400 | 3900 |
| Glykoproteiner i retentate (CPM) c | 371.700 | 127.695 |
| Dolichol-oligosackarider i retentate (CPM) d | 4350 | 540 |
| Dolichol-oligosackarider i retentate (%) e | 1,4 ± 0,7 | 0,2 ± 0,2 |
Tabell 1. Analys av utsläpp av N-bundna socker kedjor med deglycosidases och av förekomsten av dolichol-oligosackarider i glykoprotein prover.
Vi tillämpade puls-jakt förfarande för att ett lysat från NIH 3T3 celler. Efter Microcon filtrering, stämplades N-bundna oligosackarider frigörs främst med Endo H efter pulsen märkning (hög mannos typ) och med ytterligare behandling med N-glycosidase F efter en jakt period, vilket skulle motsvara komplex typ (Golgi bearbetade glykaner) Endo H resistenta oligosackarider. Denna kvantitativa analysen fram till att dolichol-oligosackarider, svarade för en obetydlig del av etiketten i den inledande retentate.
Anmärkningar:
- NIH 3T3 celler puls märkt med [2 - 3 H] mannos och jagade med komplett medium. Efter cellslys och filtrering genom Microcon YM30, var höga mannos N-bundna oligosackarider utsläppt från retentates genom inkubering med endo H.
- Endo H-beständiga material i Microcon retentates från (a) var då inkuberas med N-glycosidase F och släpptes oligosackarider mätas på ett scintillationsräknare.
- Microcon retentates erhålls som i (a) innan endo H behandling utvanns 4 gånger med kloroform: metanol: vatten 10:10:03 ta bort föregångare glykolipider och unextracted materialet solubilized i 1N NaOH och räknas i en scintillationsräknare.
- Dolichol-oligosackarider var renat från utdrag från (c) som beskrivs i 1 och räknas i en scintillationsräknare.
- Genomsnitt av tre experiment procent av dolichol-oligosackarider (d) av den totala CPM i retentate (c + d).
Representativa resultat
Figur 1. Puls-jakt analys av alla NIH 3T3 glykoproteiner hos obehandlade celler och på proteasomal hämning Efter 1h puls-märkning med. [2 - 3 H] vi fått en förväntad profil med några glucosylatedprekursorer återstående (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) och G1M9), men de flesta av etiketten finns i M9 och M8 arter, det senare ett resultat av trimning av alla glukos och en mannos rester (Figur 1 A). Inga fria mannos eller andra små prekursorer upptäcktes, som intygar att grundlighet av rening. Efter en ganska lång 8h jaga det fanns mer omfattande trimning till M7-6 och en liten mängd M5, men större arter fortsatt M9 och M8 (Figur 1 B). Om jakten skedde i närvaro av en proteasomal-hämmare (30 mikroM MG-132), fanns det bara en mindre ansamling av dessa trimmade samma art (Figur 1 C).
Figur 2. Kvantitativ analys av socker kedjor av en ERAD substrat jämfört med det totala glykoproteiner. (A) I ett experiment liknande det i figur 1, var den relativa molar mängder av varje oligosackarid arter beräknats utifrån mannos innehåll. Vi konverterade CPM värden som erhålls för varje glycan arter var procent av varje art i förhållande till den totala summan av de relativa molar mängder av alla arter som förekommer då ritas som en funktion av jakt tid för ett genomsnitt av två experiment. (B) liknande till (A) förutom att glycans frigörs från ERAD substratet ASGPR H2a analyserades efter pulsen märkning och jaga för upp till 4 timmar, i närvaro eller frånvaro av proteasomal hämmare MG-132. (C) Värden i 4h jaga i närvaro MG-132 från (A) och (B) jämförs för ASGPR H2a och glykoprotein poolen. (D) ordning för N-kopplade socker kedja trimma processer i ER. Socker trimma processer som leder till M6-5 kopplat till proteiner (R) som är riktade till ERAD jämfört med M9-8 på dem som utgång till Golgi och därefter. Resultaten visar att ERAD processen är förknippade med mannos trimning av N-glykaner ge arter med 5-6 mannos rester kvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pulsen-jakt analys av glykaner i levande celler med HPLC separation ger en metod för att studera dynamiken i oligosackarid strukturella förändringar under hela livet för en glykoprotein. Det finns allt fler bevis för att sådana förändringar är involverade i att producera signaler för ER vikning, kvalitetskontroll och system för handel med 2-5. Metoden kan tillämpas inte bara för ett specifikt glykoprotein av intresse, utan också för att analysera dynamiken i den struktur totala glykoproteiner, vilket illustreras i denna artikel, där vi jämförde kontrasterande ödet för en viss ERAD substrat och den cellulära glykoprotein poolen . Rening Tekniken är enkel men ändå specifika. Genom att använda strikt deglycosidases och molekylär filtrering det säkerställs att endast N-bundna glykaner frigörs från glykoproteiner erhålls, lämnar efter andra makromolekyler märkt med [2 - 3 H] Människan, såsom O-länkade socker kedjor och GPI-förankrade proteiner. Oligosackarider frigörs från dolichol föregångare är en obetydlig förorening (Tabell 1).
Metoden ger en hög känslighet för upptäckt med hjälp av en mycket liten mängd utgångsmaterial. När räknar med en mycket låg avkastning, kan känsligheten ökas ytterligare genom att minska volymen av HPLC fraktioner med SpeedVac. Således kan lösligheten begränsning av scintillation vätska övervinnas och hela innehållet av de fraktioner som kan övervakas i scintillationsräknare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Zehavit Frenkel och Sandra Tolchinsky för tekniskt stöd. Forskning i samband med detta arbete stöds med bidrag från Israel Science Foundation (1229-1207) och tyska-israeliska Projekt Samarbete (DIP-DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
