Summary
We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.
Abstract
Bevestiging van de Glc
Protocol
Het volgende protocol is bedoeld voor de analyse van suiker ketens van in totaal glycoproteïnen of van een specifiek glycoproteïne van belang. De procedure is in principe hetzelfde voor beide gevallen met een paar kleine aanpassingen, zoals vermeld in het gehele protocol.
- Voor metabole de etikettering van N-gekoppelde glycanen moet men een subconfluent cultuur van zoogdiercellen 's nachts gekweekt in een 90 mm schaal voor elk monster gebruik (monsters kunnen vertegenwoordigen verschillende tijdstippen of behandelingen). Dit protocol is geoptimaliseerd voor NIH 3T3-cellen.
- Verhongeren de cellen voor glucose door incubatie in 5 ml vers bereide voorverwarmde (37 ° C) glucose-vrij medium, geleverd met 10% gedialyseerd FCS en 4 mM natriumpyruvaat voor 5-15 minuten.
- Vervang de honger medium met 1 ml van de voorverwarmde (37 ° C) glucose-vrij medium dat 400 pCi van [2 - 3 H]-gelabeld mannose (lagere concentratie van 65 uCi / ml wordt gebruikt voor het labelen van het totaal glycoproteïnen), en Incubeer de cellen in het normale weefselkweek voorwaarden voor een uur.
- Verwijder het etiket medium van elk monster, en voorzichtig 2 ml PBS toe te voegen bij 4 ° C om de monsters die overeenkomen met pols en plaats ze op ijs (deze monsters worden aangeduid als pulsen), terwijl de monsters die overeenkomt met de jacht moeten worden 3 keer gespoeld met 2 ml van de voorverwarmde (37 ° C) normale volledige cultuur medium, en vervolgens geplaatst in een CO 2 incubator bij 37 ° C met 5 ml van de voorverwarmde reguliere medium voor de gewenste chase periodes.
- Spoel de pols monsters (eerder geplaatst op ijs) drie keer met 2 ml ijskoud PBS. De cellen worden vervolgens afgeschraapt de schotel in 2 ml PBS behulp van een mobiele schraper, en geplaatst in een 2 ml Eppendorf buis.
- Korte draai de cellen op 16000Xg (6-10 sec), gooi de supernatant en bevriezen van de cel pellet bij -80 ° C.
- Voer stap 5 en 6 ook voor de jacht monsters aan het einde van de jacht tijd.
- Verwijder de cellen van de vriezer en lyse hen door toevoeging van 300 ul buffer A, vortexen kort en incubatie gedurende 20 min op ijs, of in het geval van totale glycoproteïnen analyse, door incubatie 20 min op ijs met buffer B, gevolgd door sonicatie (4 keer, 10 sec, maximale amplitude), dan kook de monsters voor 5min.
- Centrifugeer de lysaten op 16000Xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande om een nieuw Eppendorf buis en gooi de pellet.
- Als het analyseren van het totaal glycoproteïnen, ga dan naar moleculaire filtratie en deglycosylatie (stap 17). Voor immunoprecipitatie van de H2a glycoproteïne hier gedemonstreerd, voeg 20l/sample van (Repligen) eiwit A-agarose parels 01:01 schorsing en 3 pl / monster van ons konijn polyklonaal anti H2a antilichaam voor de gewenste glycoproteïne (in ons voorbeeld anti-H2a antilichaam ), het supernatans van stap 9.
- Incubeer de monsters voor 4-16 uur bij 4 ° C, voortdurend mengen door langzame rotatie.
- Spin down van de kralen aan 16000Xg gedurende 30 seconden, en verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van vacuüm.
- Spoel de korrels, door het toevoegen van 500 pi buffer D en vortexen. Spin als in stap 12 en verwijder het supernatant. Herhaal de wasbeurt 3 keer.
- Voeg 10μl denatureren buffer (meegeleverd met de nationale handhavingsinstanties endo-H kit) aan de hiel pellet en kook de monsters gedurende 5 minuten (wanneer de totale eiwitten worden geanalyseerd, de deglycosylatie wordt uitgevoerd op de Microcon filter, stap 17).
- Spin down van de beads (16000Xg gedurende 30 seconden), en breng de supernatant in een nieuw Eppendorf buis. Dan 0.5μl van endo H enzym worden toegevoegd aan elk monster, samen met 10 ul van de reactie buffer (ook geleverd met de nationale handhavingsinstanties endo H kit), en de monsters worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur.
- Het scheiden van de vrijgekomen glycanen van de eiwitten, wordt het monster verdund 5 keer met gedemineraliseerd water en geplaatst op de top van een moleculaire filter (Microcon Ultracel YM30), met een 30kDa cut-off, daarna gecentrifugeerd bij 14000Xg gedurende 3 minuten. Van toepassing zijn 50μl gedeïoniseerd water en herhaal centrifugeren van de monsters. Deze wash-out wordt herhaald twee keer, waardoor de flow-through.
- Als u het analyseren van totale glycoproteïnen, passen de supernatant van de lysaten (van stap 9) naar de Microcon filter. Was het extract met 100 ul buffer E, drie keer door herhaalde centrifugatie bij 14000Xg gedurende 3 minuten. Voeg 3 pl 10X endo H reactiebuffer en 1,5 pi van het endo H enzym aan de Microcon retentaat, en gedurende 3 uur bij 37 ° C. incubeer De vrijgekomen glycanen worden geëlueerd met gedemineraliseerd water door drie herhaalde centrifugations, zoals in stap 16.
- Indien gewenst, worden retentaten van de stappen 16 en 17, met endo H-resistente glycoproteïnen vervolgens geïncubeerd met 200mU van N-glycosidase F in 15 ul van buffer C, bij 37 ° C gedurende 16 uur Elutie met gedemineraliseerd water wordt gedaan als in stap 16.
- Plaats de buis met de endo H reactie doorstroom (stappen 16 en 17) in een SpeedVac concentrator, En volledig droog de samples (dit kan worden gedaan tot 45 ° C om dit proces te versnellen).
- Ter voorbereiding van de monsters voor de HPLC, resuspendeer de droge korrels in 12 ul van de HPLC-oplosmiddel (acetonitril: water, 60:40, 1% fosforzuur).
- Stel de HPLC-apparaat (aangesloten op de Spherisorb kolom) om een constante stroom van het oplosmiddel (1 ml / min) en druk (een bepaalde waarde tussen 1000 en 2000 psi), en plaats een fractie verzamelaar om een buis te veranderen om de 1 minuut.
- Laad de monsters in het HPLC-apparaat en tegelijkertijd starten de fractie verzamelaar.
- Verzamel 48 fracties van 1 ml van elk monster lopen en van een run van een standaard oligosaccharide mengsel.
- Transfer 500 pi van elke fractie in een scintillatieflesje, en meng de inhoud met 3 ml water mengbare scintillatievloeistof.
- Laad de flacons en lezen in een scintillatieteller.
- Het cpm uitlezing is uitgezet als functie van fractie-nummer.
- De CPM waarden binnen een piek vertegenwoordigen een specifieke glycan soorten als volgt: 18-21 fracties komen overeen met M5, fracties 22-26 tot M6, breuken 27-31 tot M7, breuken 32-35 tot M8, breuken 36-39 tot M9, fracties 40-42 te G1M9 en fracties 43-45 te G2M9.
- De som van cpm waarden voor de fracties binnen elke piek weerspiegelt de absolute hoeveelheid van een bepaalde glycan soort. Ter compensatie voor het feit dat soorten die meer mannose residu's meer label, de "relatieve molaire hoeveelheid" van elke glycaan soort wordt als volgt berekend te verwerven: de absolute hoeveelheid van elke soort glycaan wordt gedeeld door het aantal mannose residuen die het bevat . Deze waarde wordt vervolgens gedeeld door de som van de relatieve molaire hoeveelheden van alle glycaan soorten die tot de "procent van de totale" te verkrijgen voor elke specifieke glycan soort.
| Chase (h) | 0 | 4 |
| Vrijgegeven met endo H (cpm) een | 90000 | 16800 |
| Uitgebracht met N-glycosidase F (cpm) b | 20400 | 3900 |
| Glycoproteïnen in retentaat (cpm) c | 371700 | 127695 |
| Dolichol-oligosachariden in retentaat (cpm) d | 4350 | 540 |
| Dolichol-oligosachariden in retentaat (%) e | 1,4 ± 0,7 | 0,2 ± 0,2 |
Tabel 1. Analyse van de afgifte van N-gebonden suiker ketens met deglycosidases en van de aanwezigheid van dolichol-oligosacchariden in glycoproteïne monsters.
We pasten de pulse-chase procedure om een lysaat uit NIH 3T3-cellen. Na Microcon filtratie, werden bestempeld N-gekoppelde Oligosacchariden voornamelijk vrijgegeven met endo H na labeling puls (hoge mannose-type) en bij verdere behandeling met N-glycosidase F na een achtervolging periode, die zou overeenkomen met complexe type (Golgi-verwerkt glycanen), endo H tegen oligosacchariden. Deze kwantitatieve analyse vast dat dolichol-oligosacchariden, goed voor een onbeduidende fractie van het label in de eerste retentaat.
Opmerkingen:
- NIH 3T3 cellen werden puls gelabeld met [2 - 3 H] mannose en achterna gezeten met een complete medium. Na de cel-lysis en filtratie door Microcon YM30, waren hoog mannose N-gekoppelde Oligosacchariden vrijgelaten uit retentaten door incubatie met endo H.
- Endo H-bestendig materiaal in Microcon retentaten van (een) werd vervolgens geïncubeerd met N-glycosidase F en vrijgegeven oligosacchariden gemeten in een scintillatieteller.
- Microcontroller retentaten verkregen als in (a) voor de endo H behandeling, werden geëxtraheerd 4 keer met chloroform: methanol: water 10:10:03 van precursoren glycolipiden te verwijderen en de unextracted materiaal opgelost in 1N NaOH en geteld in een scintillatieteller.
- Dolichol-oligosacchariden werden gezuiverd uit extracten van (c), zoals beschreven in een en geteld in een scintillatieteller.
- Gemiddelde van 3 experimenten voor procent van de dolichol-oligosachariden (d) van de totale cpm in retentaat (c + d).
Representatieve resultaten
Figuur 1. Pulse-chase analyse van het totaal NIH 3T3 glycoproteïnen in onbehandelde cellen en op proteasomale remming Na 1u puls-labeling met. [2 - 3 H] kregen we een verwacht profiel met enkele glucosylatedvoorlopers resterende (GLC 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) en G1M9), maar de meeste van het label in M9 en M8 soorten, waarbij de laatste het gevolg is van trimmen van alle glucose en een mannose residu (figuur 1 A). Geen gratis mannose of andere kleine voorlopers werden gedetecteerd, waaruit blijkt dat de grondigheid van de zuivering. Na een vrij lange achtervolging 8 uur was er meer uitgebreide trimmen tot M7-6 en een kleine hoeveelheid van de M5, maar de belangrijkste soorten bleef M9 en M8 (figuur 1 B). Als de jacht werd gedaan in de aanwezigheid van een proteasomale-remmer (30 uM MG-132), was er slechts een geringe accumulatie van deze zelfde gesneden soorten (figuur 1 C).
Figuur 2. Kwantitatieve analyse van suiker ketens van een ERAD substraat ten opzichte van de totale glycoproteïnen. (A) In een experiment vergelijkbaar met dat in figuur 1, werden de relatieve molaire hoeveelheden van elke soort oligosaccharide berekend op basis van mannose inhoud. We zette de cpm waarden verkregen voor elke glycan soort, het percentage van elke soort ten opzichte van de totale som van de relatieve molaire hoeveelheden van alle soorten die aanwezig was toen uitgezet als functie van de jacht tijd voor een gemiddelde van twee experimenten. (B) Vergelijkbare naar (A), behalve dat glycanen vrijkomt uit de ERAD substraat ASGPR H2a werden geanalyseerd na de puls etikettering en jagen voor maximaal 4 uur, in de aanwezigheid of afwezigheid van de proteasomale inhibitor MG-132. (C) Waarden voor 4 uur jacht in de aanwezigheid van de MG-132 uit (A) en (B) worden vergeleken voor ASGPR H2a en het glycoproteïne zwembad. (D) Schema van N-gebonden suiker keten trimmen processen in het ER. Sugar trimmen processen die leiden tot M6-5 gekoppeld aan eiwitten (R) die moeten ERAD gericht in vergelijking met M9-8 op die uitgang naar het Golgi en daarbuiten. De resultaten geven aan dat de ERAD proces wordt geassocieerd met de mannose trimmen van N-glycanen tot soorten rendement met 5-6 mannose residu overgebleven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De pulse-chase analyse van suikers in levende cellen met HPLC-scheiding biedt een methode voor het bestuderen van de dynamiek van oligosaccharide structurele veranderingen gedurende de gehele levensduur van een glycoproteïne. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat dergelijke wijzigingen zijn betrokken bij de productie van de signalen voor ER vouwing, kwaliteitscontrole en-handel systemen 2-5. De methode kan worden toegepast, niet alleen voor een specifiek glycoproteïne van belang, maar ook voor het analyseren van de dynamiek van de structuur van het totaal glycoproteïnen, zoals geïllustreerd in dit artikel, waar we ten opzichte van de contrasterende lot van een specifieke ERAD substraat en die van de cellulaire glycoproteïne zwembad . De zuivering techniek is eenvoudig, maar toch specifiek. Door het gebruik van strikte deglycosidases en moleculaire filtratie ervoor wordt gezorgd dat alleen N-gekoppelde glycanen vrijgelaten uit glycoproteïnen zijn verkregen, met achterlating van andere macromoleculen gelabeld met [2 - 3 H] De mens, zoals O-gebonden suikerketens en GPI-anker eiwitten. Oligosacchariden vrijkomt uit de dolichol voorloper zijn een te verwaarlozen contaminant (tabel 1).
De methode biedt een hoge gevoeligheid van detectie met behulp van een zeer kleine hoeveelheid van uitgangsmateriaal. Wanneer verwacht een zeer lage opbrengst, kan de gevoeligheid verder worden verhoogd door vermindering van het volume van de HPLC-fracties met behulp van SpeedVac. Zo kan de oplosbaarheid beperking van de scintillatievloeistof worden overwonnen, en de gehele inhoud van de fracties kan worden gevolgd in het scintillatieteller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Zehavit Frenkel en Sandra Tolchinsky voor technische bijstand. Onderzoek in verband met dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (1229-1207) en de Duits-Israëlische Project Samenwerking (DIP-DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
