Summary
Nós descrevemos um método para análise da alteração da N-glicanos ligados através do início da vida de glicoproteínas após a sua biossíntese em células de mamíferos. Isto é conseguido através de pulso-chase análise de glicanos metabolicamente marcados, a liberação enzimática das glicoproteínas e análise por HPLC.
Abstract
Fixação do Glc
Protocol
O seguinte protocolo destina-se a análise de cadeias de açúcar de glicoproteínas total ou de uma glicoproteína específica de interesse. O procedimento é basicamente o mesmo para ambos os casos, com algumas alterações como indicado ao longo do protocolo.
- Para a rotulagem metabólica de N-glicanos ligados a pessoa precisa usar uma cultura confluentes de células de mamíferos cultivadas durante a noite em um prato de 90 mm para cada amostra (amostras podem representar diferentes momentos ou tratamentos). Este protocolo é otimizado para as células NIH 3T3.
- Morrer de fome as células para a glicose através da incubação em 5 ml de recém-preparados médio pré-aquecido (37 ° C), glicose-free, fornecido com 10% FCS dialisadas e 4 mM piruvato de sódio por 5-15 minutos.
- Substituir o meio de fome com 1 ml da pré-aquecido (37 ° C) sem glicose meio contendo 400 μCi de [2-3 H] marcado manose (menor concentração de 65 μCi / ml é utilizado para a rotulagem de glicoproteínas total), e incubar as células do tecido normal condições de cultura para uma hora.
- Remova a mídia de rotulagem de cada amostra e, cuidadosamente, adicionar 2 ml de PBS a 4 ° C para as amostras correspondentes a pulso e coloque-os sobre gelo (estas amostras são referidos como pulsos), enquanto as amostras correspondentes ao assunto precisa ser lavado 3 vezes com 2 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura normal, completa, e depois colocados em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C com 5 ml de pré-aquecido médio regular para o período desejado perseguição.
- Lave as amostras de pulso (previamente colocado no gelo) 3 vezes com 2 ml de PBS gelado. As células são então raspado o prato em 2 ml de PBS com uma espátula de células, e colocado em um tubo Eppendorf 2 ml.
- Curto girar a células em 16000Xg (6-10 seg), desprezar o sobrenadante e congelar o pellet celular a -80 ° C.
- Execute os passos 5 e 6 também para as amostras de perseguição no final do tempo de perseguição.
- Remove as células do congelador e lisar-los através da adição de 300 l de tampão A, brevemente vórtex e incubar por 20 min no gelo, ou no caso de análise de glicoproteínas total, por 20 min de incubação no gelo com tampão B, seguidos por sonicação (4 vezes, 10 segundos, máxima amplitude), em seguida, ferver as amostras para 5min.
- Centrifugar a lisados em 16000Xg por 20 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um tubo Eppendorf novo e descartar o pellet.
- Se a análise de glicoproteínas total, proceder à filtração molecular e deglycosylation (passo 17). Para imunoprecipitação da glicoproteína H2a demonstrado aqui, adicione 20l/sample de (Repligen) proteína A-agarose contas 01:01 de suspensão e 3 mL / amostra do nosso coelho anticorpo policlonal anti H2a para a glicoproteína desejado (no nosso exemplo de anticorpos anti-H2a ), para o sobrenadante do passo 9.
- Incubar as amostras para 4-16 horas a 4 ° C, em constante mistura por rotação lenta.
- Spin para baixo as contas em 16000Xg por 30 segundos, e remova cuidadosamente o vácuo sobrenadante usando.
- Lave as contas, por adição de 500 mL de buffer D e vórtice. Rotação como no passo 12 e remover o sobrenadante. Repetir a lavagem três vezes.
- Adicionar 10μl tampão de desnaturação (fornecido com o endo-H NEB kit) para o pellet talão e ferva as amostras por 5 min (quando as proteínas totais são analisados, a deglycosylation é realizado no filtro microcontrolador, passo 17).
- Girar as esferas (16000Xg por 30 segundos), e transferir o sobrenadante para um tubo Eppendorf novo. Então 0.5μl da enzima endo H são adicionados a cada amostra, juntamente com 10 ml do tampão de reação (também fornecido com o kit H endo NEB) e as amostras são incubadas a 37 ° C por 3 horas.
- Para separar os glicanos liberada a partir das proteínas, a amostra é diluída 5 vezes com água deionizada e colocado em cima de um filtro molecular (microcontrolador Ultracel YM30), com um corte de 30kDa, em seguida, centrifugado a 14000Xg por 3 min. Aplicar 50μl de água deionizada e repetir a centrifugação das amostras. Esta lavagem é repetida vezes mais 2, mantendo o escoamento.
- Se você está analisando glicoproteínas total, aplicar o sobrenadante do lisados (a partir do passo 9) para o filtro microcontrolador. Lavar o extrato com 100 l de tampão E, 3 vezes por centrifugação repetida em 14000Xg por 3 min. Adicionar 3 mL de tampão de reação 10X endo H e 1,5 mL da enzima endo H ao retentado microcontrolador, e incubar durante 3 horas a 37 ° C. Os glicanos liberados são eluídos com água deionizada por 3 centrifugações repetidas, como no passo 16.
- Se desejar, retentados das etapas 16 e 17, contendo endo H-resistentes glicoproteínas são então incubadas com 200mU de N-glicosidase F em 15 mL de tampão C a 37 ° C por 16 h. Eluição com água deionizada é feito como na etapa 16.
- Coloque o tubo que contém o endo H reação de fluxo (etapas 16 e 17) em um concentrador SpeedVac, E secar as amostras completamente (este pode ser feito até 45 ° C para acelerar esse processo).
- Para preparar as amostras para a HPLC, ressuspender o pellets secos em 12 mL do solvente HPLC (acetonitrila: água, 60:40, ácido fosfórico 1%).
- Ajustar o dispositivo de HPLC (conectado à coluna Spherisorb) para fluxo constante de solvente (1 ml / min) e pressão (um valor em particular entre 1000 e 2000 psi), e colocar um coletor de frações para mudar um tubo a cada 1 minuto.
- Carregar as amostras no dispositivo HPLC e iniciar o coletor de fração ao mesmo tempo.
- Coletar 48 frações de 1 ml de cada amostra e executar de uma corrida de uma mistura padrão de oligossacarídeos.
- Transferência de 500 mL de cada fração para um frasco de cintilação, e misturar o conteúdo com 3 ml de água-miscível líquido de cintilação.
- Carregar os frascos e lido em um contador de cintilação.
- A leitura cpm é plotado como uma função do número fracionário.
- Os valores cpm dentro de um pico de representar uma espécie específica glicano como segue: frações 18-21 correspondem a M5, M6 para frações 22-26, 27-31 frações de M7, frações 32-35 a M8, frações 36-39 a M9, frações 40-42 para 43-45 G1M9 e frações de G2M9.
- A soma dos valores cpm para as frações dentro de cada pico reflete a quantidade absoluta de uma espécie glicano específico. , A fim de compensar o fato de que as espécies que contenham mais resíduos de manose adquirir mais etiqueta, a "quantidade relativa molar" de cada espécie glicano é calculado da seguinte forma: a quantidade absoluta de cada espécie glicano é dividido pelo número de resíduos de manose que contém . Este valor é então dividido pela soma dos montantes relativos molar de todas as espécies glicano obtidos para obter o "por cento do total" para cada espécie glicano específico.
| Chase (h) | 0 | 4 |
| Lançado com endo H (cpm) a | 90000 | 16800 |
| Lançado com N-glicosidase F (cpm) b | 20400 | 3900 |
| Glicoproteínas no retentado (cpm) c | 371700 | 127695 |
| Dolicol-oligossacarídeos no retentado (cpm) d | 4350 | 540 |
| Dolicol-oligossacarídeos no retentado (%) e | 1,4 ± 0,7 | 0,2 ± 0,2 |
Tabela 1. Análise da liberação de cadeias N-linked açúcar com deglycosidases e da presença de Dolicol-oligossacarídeos em amostras de glicoproteína.
Foi aplicado o procedimento de pulso-caça a um lisado de células NIH 3T3. Após filtração microcontrolador, rotulado N-linked oligossacarídeos foram liberados principalmente com endo H após a rotulagem de pulso (tipo manose alta) e com tratamento adicional com N-glicosidase F após um período de perseguição, o que corresponderia a tipo complexo (Golgi-processados glicanos), oligossacarídeos endo H resistente. Esta análise quantitativa determinou que Dolicol-oligossacarídeos, foi responsável por uma fração insignificante do rótulo no retentado inicial.
Notas:
- Células NIH 3T3 foram pulso marcado com [2-3 H] manose e perseguido com meio completo. Após a lise celular e filtração através de microcontrolador YM30, alta manose N-linked oligossacarídeos foram liberados de retentados de incubação com Endo H.
- Endo material de H-resistentes em retentados microcontrolador a partir de (a) foi então incubada com N-glicosidase F e liberado oligossacarídeos medida em um contador de cintilação.
- Retentados microcontrolador obtida como em (a) antes do tratamento endo H, foram extraídos quatro vezes com clorofórmio: metanol: água para remover 10:10:03 glycolipids precursor, eo material não extraído solubilizado em NaOH 1N e contados em um contador de cintilação.
- Dolicol-oligossacarídeos foram purificados de extratos a partir de (c) como descrito em 1 e contados em um contador de cintilação.
- Média de 3 experimentos para por cento do Dolicol-oligossacarídeos (d) de cpm total de retentado (c + d).
Resultados representante
Figura 1. Pulso-chase análise de glicoproteínas total de NIH 3T3 em células não tratadas e sobre a inibição proteosomal Após 1h de pulso com rotulagem. [2-3 H] obtivemos um perfil esperado com alguma glucosylatedprecursores restante (Glc Man 2 9 GlcNAc 2 (G2M9) e G1M9), mas a maioria do rótulo presente em M9 e M8 espécies, sendo este último o resultado do corte de toda a glicose e um resíduo de manose (Figura 1 A). No free manose ou outros pequenos precursores foram detectados, atestando a meticulosidade da purificação. Na sequência de um pouco longo 8h perseguição havia mais extenso corte para M7-6 e uma pequena quantidade de M5, mas as principais espécies continuaram a ser M9 e M8 (Figura 1 B). Se a perseguição foi feito na presença de um inibidor proteosomal (30 mM MG-132), havia apenas um acúmulo menor dessas espécies mesmo aparadas (Figura 1 C).
Figura 2. Análise quantitativa de cadeias de açúcar de um substrato ERAD comparação com glicoproteínas total. (A) Em um experimento semelhante ao da Figura 1, relativa quantidade molar de cada espécie de oligossacarídeos foram calculados com base no conteúdo de manose. Convertemos os valores obtidos cpm para cada espécie glicano, a porcentagem de cada espécie em relação à soma total dos valores relativos molar de todos os presentes espécies foi então plotado como uma função do tempo de perseguição por uma média de dois experimentos. (B) Similar para (A), exceto que glicanos liberado do substrato ERAD ASGPR H2a foram analisados após a rotulagem de pulso e de perseguição por até 4h, na presença ou ausência do inibidor proteosomal MG-132. (C) Os valores para 4h de perseguição na presença da MG-132 a partir de (A) e (B) são comparados para ASGPR H2a ea piscina glicoproteína. (D) Regime de N-linked cadeia de açúcar corte processos na ER. Processos de corte de açúcar que levam à M6-5 ligado às proteínas (R) que são direcionados para ERAD comparação com M9-8 sobre aqueles que sair para o Golgi e além. Os resultados indicam que o processo ERAD é associado com a manose corte de N-glicanos para produzir espécies com 5-6 resíduos de manose restantes.
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Discussion
A análise do pulso-chase dos glicanos em células vivas, com separação por HPLC fornece um método para estudar a dinâmica do oligossacarídeo alterações estruturais ao longo da vida de uma glicoproteína. Há evidências crescentes de que tais alterações estão envolvidos na produção dos sinais de ER dobrar, controle de qualidade e 2-5 sistemas tráfico. O método pode ser aplicado não só para uma glicoproteína específica de interesse, mas também para analisar a dinâmica da estrutura de glicoproteínas total, como ilustrado neste artigo, onde se comparou o destino contrastantes de um substrato ERAD específicos e que a piscina glicoproteína celular . A técnica de purificação é simples, mas ainda assim específicos. Usando deglycosidases rigorosa e filtração molecular é assegurado que apenas N-linked glicanos liberado de glicoproteínas são obtidos, deixando para trás outras macromoléculas marcadas com [2-3 H] Man, como as cadeias O-ligados açúcar e GPI ancorada às proteínas. Oligossacarídeos liberados a partir do precursor Dolicol são um contaminante desprezível (Tabela 1).
O método fornece uma alta sensibilidade de detecção utilizando uma quantidade muito pequena de matéria-prima. Quando se espera um rendimento muito baixo, a sensibilidade pode ser aumentada pela redução do volume das frações HPLC usando SpeedVac. Assim, a limitação de solubilidade do fluido de cintilação pode ser superado, e todo o conteúdo das frações podem ser monitorados no contador de cintilação.
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Acknowledgments
Agradecemos a Zehavit Frenkel e Sandra Tolchinsky para assistência técnica. Pesquisas relacionadas a este trabalho é suportado por concessões do Ciência Israel Foundation (1229-1207) eo alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
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