Biz Gabor gibi tek bir canlı hücre içinde hücre içi dinamiklerini ölçmek için filtreleme dayalı bir karanlık alan mikroskobu yöntemi göstermektedir. Teknik mitokondriyal parçalanma gibi organellerin yapısında değişiklikler, duyarlı.
Abstract
Biz lekesiz canlı hücrelerin içinde organel morfolojisi ve organizasyon kaynaklanan hücre içi doku ölçebilirsiniz mikroskopik bir enstrüman ortaya koymaktadır. Önerilen araç organel boyut ve şekil nanoölçekli değişiklikleri, etiket optik mikroskopi hassasiyet uzanır ve programlanmış hücre ölümü ya da hücresel organel dinamikleri altında yatan temel biyolojik süreçlere ilişkin yapı-işlev ilişkisi çalışmada, hızlandırmak için kullanılabilir farklılaşması. Mikroskop kolayca mevcut mikroskopi platformlarda uygulanacak ve bu nedenle, bilim adamları, uygulamak ve sınırsız erişim ile önerilen yöntemler kullanabilirsiniz bireysel laboratuarlar, dissemine olabilir.
Önerilen tekniği iki boyutlu optik Gabor filtreleri yoluyla hücre gözlemleyerek ve hücre içi yapısını karakterize etmek mümkün. Bu filtreler anlamda nano ölçekli (10 nm) hassasiyet, boyutu ve yönü olmayan küresel hücre içi organelleri ile ilgili spesifik morfolojik özellikleri ile ayarlanmış olabilir. Elastik saçılma tarafından oluşturulan kontrast dayalı, teknik, detaylı bir ters saçılma modeli veya Mie teorisi üzerine morfometrik ölçümler ayıklamak için güvenmeye gelmez. Bu teknik, bu yüzden kesin bir teorik dağılım açıklamasına kolayca verilmez için küresel olmayan organelleri ve fonksiyonunu değerlendirmek için lekesiz canlı hücrelerin içinde elde edilebilir ayırt edici morfometrik parametreler sağlar. Discretized nesnenin yoğunluğu yerine dönüşümü doğrudan nesne alanında faaliyet gösterdiği dijital görüntü işleme tekniği göre avantajlıdır. Yüksek görüntü örnekleme oranları dayalı değildir ve bu nedenle oldukça büyütülmüş dijital görüntüler floresan konfokal mikroskopi tek tek organel segmentasyon ve yeniden yapılanma ötesine böylece büyük ölçüde organel yapısı çalışmanın kolaylaştırılması, hızla bir seferde yüzlerce hücre içinde morfolojik aktivite ekranı için kullanılabilir sınırlı görüş alanları.
Bu gösteriye metodoloji göstermek için bir deniz diatom veri göstermektedir. Biz de ilgili bir biyolojik bağlamda yöntem nasıl uygulanabilir bir fikir vermek için canlı hücreler alınan ön veriler göstermektedir.
Protocol
1. Hücrelerin hazırlanıyor Gerekir önce mitokondri floresan görüntüleme için Mitotracker yeşil etiketli olmak için gün kaplanmış hücre. 100 mcM stok solüsyonu Mitotracker DMSO yeşil önceden yapılmış, 4 ° C derin dondurucu ve el ile oda sıcaklığına çıkarın. Ayrıca, sığır aort endotel hücreleri (BAEC) ° C benchtop su banyosunda 37 de önceden hazırlanmış ve sıcak hücre kültür ortamı çıkarın. Mitotracker ve kültür ortamı ısındı sonra, eldiven…
Discussion
Bu yöntem, örneğin parçacık boyutunu veya yönünü kodlamak nesnenin verim morfometrik haritalar yukarıda açıklanan. Bu yapısal bilgiler çeşitli şekillerde kullanılabilir:
Bu, belirli bir tedavisi sırasında değiştirilmiş ve daha sonra bu bölgelerde spesifik moleküler ve biyokimyasal testlerin analiz doku veya hücre bölgeleri belirlemek için bir başlangıç ekranı olarak kullanılabilir.
Bu hücrelerin hücre içi yapısı (bu yöntemle) kantitatif karakterizasyonu i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma mikro ayna cihazı, N. Boustany, Whitaker Vakfı Hibe RG-02-0682 tarafından finanse edildi. Devam eden işler N. Boustany NSF DBI-0852857 hibe tarafından finanse edilmektedir. RM Pasternack kısmen Rutgers Cumhurbaşkanlığı Yüksek Lisans Bursu ile desteklenmiştir. Biz de yararlı bir tartışma için optik filtreleme stratejileri ile ilgili çalışmalar ve Dr. DN Metaxas kullanılan iBMK hücreler için Dr. E. Beyaz teşekkür etmek istiyorum.
Boustany, N. N., Pasternack, R. M., Zheng, J. Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters. J. Vis. Exp. (40), e1915, doi:10.3791/1915 (2010).