二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

Summary

我々は、単一の生細胞内で細胞内動態を測定するためのフィルタリングガボールのように基づいて、暗視野顕微鏡法を示しています。技術は、ミトコンドリアの断片化などの細胞小器官の構造の変化に敏感です。

Abstract

我々は、染色生細胞内で細胞小器官の形態と組織に起因する細胞内のテクスチャを測定することができる微細な楽器を示しています。提案された楽器は、オルガネラのサイズと形状のナノスケールの変化にラベルフリーの光学顕微鏡の感度を拡張し、そのようなプログラム細胞死や細胞のような基本的な生物学的プロセスを、根底にあるオルガネラダイナミクスに関する構造機能相関の研究を加速するために使用することができます。分化。顕微鏡は簡単に既存の顕微鏡のプラットフォーム上で実装することができますので、科学者が無制限にアクセスできる提案手法を実装して使用できる個々の研究室、に普及することができます。

提案手法は、2次元光ガボールフィルタを介して細胞を観察することによって、細胞下構造を特徴づけることができます。これらのフィルタは、ナノスケール（10のnmの）感度、非球状細胞内小器官の大きさや向きに関係する特定の形態学的属性と意味するように調整することができます。弾性散乱によって生成されたコントラストに基づいて、一方で、技術は、形態学的測定値を抽出する詳細な逆散乱モデル上または三重理論に依存しません。この手法は、したがって、正確な理論的なスキャッタ記述が容易に与えされていない非球面小器官に適用可能であり、その機能を評価するために染色生細胞内で取得することができる独特の形態学的パラメータが用意されています。テクニックは、離散物体の強度ではなく、変換するオブジェクトのフィールドを直接操作するという点でデジタル画像処理に比べて有利である。それは、高い画像のサンプリングレートに依存しないため、このように非常に高倍率デジタル画像の蛍光共焦点顕微鏡による個々のオルガネラのセグメンテーションと再構築を超えて細胞小器官の構造の研究を促進、急速に一度に細胞の数百の中で形態学的活性をスクリーニングするために使用することができます。ビューの限られたフィールドの。

このデモでは、方法論を説明するために海洋性珪藻からのデータを示す。我々はまた、メソッドが関連する生物学的な文脈に適用する方法のアイデアを与えるために生きている細胞から収集された予備的なデータを示しています。

Protocol

1。細胞が準備中

1. 前日に播種した細胞は、ミトコンドリアの蛍光イメージングのためのMitoTrackerにより緑で標識する必要があります。
2. MitoTrackerによりDMSO中で緑の4℃の冷凍庫から、あらかじめ作っておいた、と手で室温に暖かいの100μMのストック溶液を取り外します。また、ウシ大動脈内皮細胞（BAEC）° Cベンチトップウォーターバスで37〜また、以前に準備し、暖かい細胞培養培地を取り出してください。
3. MitoTrackerおよび培養液が暖めされると、あなたの手袋をはめた手と70％エタノール溶液と容器の外側表面すべてを殺菌することを確認してフードにこれらを配置。蛍光標識が敏感な光であり、すぐに周囲の部屋の光で退色するので、フードのライトをオンにしないでください。
4. ミトコンドリア標識のための右の濃度を作ることは非常に重要です。あまりMitoTrackerによりが毒性を持つことができますが、少なすぎると、ミトコンドリアを効果的にラベルを付けることはありません。細胞を45分間インキュベートMitoTrackerのは100nMの濃度が適しています。 15 mLの試験管に10mLの培地にMitoTrackerにより株式を100μLを加えることによってこの濃度を準備します。これは、少なくとも1つの実験のためのたくさんを行います。
5. 真空ラインに接続されているパスツールピペットで古い培地を吸引して標識した培地で、既存の媒体を交換してください。その後すぐに6ウェルプレートに各ウェル占領文化に標識した培地2 mlを加え。
6. 蛍光標識は、光に敏感なので、直接部屋の光にさらすことなく、迅速に細胞をインキュベーターに置き換えます。手で6ウェルプレートをカバーすることはこのためにうまく機能します。細胞は45分間インキュベーターに留まります。

2。光学セットアップの準備をする

1. 細胞がインキュベーターに待っている間に、我々は光学セットアップをオンにする必要があります。光学系の部屋では、最初のコンピュータ、顕微鏡、カメラ、そしてレーザーに続く、水銀アークランプをオンにします。その後、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）と回転拡散器のプラグ。
2. 光学打ち上げは視野が明るく、レーザー光が照射されていることを確認するために顕微鏡の接眼レンズを通して見ることによって整列されていることを確認してください。
3. タイトな正方形の中にレンズの紙の一枚を折り畳むことにより客観的に清掃し、止血剤と握り締める。紙にわずかな量を吸収するためにアンモニアを含まないガラスの洗浄液にレンズペーパーを浸します。ラップ空いている手で止血余った部分を削除するために数回。途中でレンズを超えずに、しっかりと端から端まで客観における1つのきれいな、連続的な強打を適用することによって目的を拭いてください。再スワイプまたはスクラブしないでください。古紙を捨てる。
4. サンプルをロードするには、目的はずっとダウンしているときに客観的な上のイマージョンオイル1〜2小滴をドロップすることによって、63x油浸対物レンズを介して目盛りを配置します。その後ステージで目盛を配置。その後、油がサンプルを"つかむ"ように目的を上げる。接眼レンズにサンプルを置いています。
5. それはコンデンサーの視野絞りの六角形のエッジを集中し、中央ケーラー照明に合うようにコンデンサーを整列するには、コンデンサーの高さを調整します。中央コンデンサーのフィールドには、コンデンサー中心にノブを回すことにより、必要に応じて、ビューのフィールドを介して停止する。コンデンサーの開口絞りを閉じる必要があります。
6. RoperScientificカスケード512カメラを操作するIPlabプログラムと入力の設定を開始します。カメラは、転送モードをフレームに設定されていることを確認してください。 "フォーカスを取得"コマンドを実行して、ライブプレビューを開始します。画像が保存されるインデックスの接頭辞とファイルの場所を設定します。
7. CoolSnapのプログラムを動作させるRSImageプログラムと入力の設定を開始します。クロッキングモードが正常に設定する必要があります。
8. DMDソフトウェアを起動し、続いて、スクリプトメニューの暗視野絞り、置いて"読み込みをしてリセット"コマンドを、スクリプトを実行します。
9. LSMに顕微鏡optovarとビューポートを設定することにより、DMDとカスケード512カメラに光を送る。これはCCDの上にDFの画像を投影し、DMDと整合光学系を介して画像をお送りします。暗視野（DF）のイメージはIPlabで既に進行中のライブプレビューに表示されます。必要に応じて、ライブプレビューで画像を集中する場合、顕微鏡の微動フォーカスを調整します。
10. "単一の取得"コマンドを使用してビューのフィールドのスナップショットを取る。画像内の信号の少なくとも10000カウントを確実にするために十分な高い露光時間を設定します。買収後は、ディスクにイメージを保存する"としてインデックスに保存"コマンドを使用します。目盛のこの画像は、視野（FOV）のサイズを測定します。
11. 今、その背景のみが表示されるように目盛がFOVを超えているように目盛のサンプルを移動する。で、フィールドの背景画像を取得する信号の少なくとも5000カウントが取得されていることを確認するために十分長い露光時間。この画像は、フィルタ処理されていない画像の背景差分に役立ちます。

3。フィルタバンクのロードとフィルタリング - 背景画像を取得するためにセットアップを使用して

1. 今、我々は背景のガボールフィルタを通した画像を取得する必要があります。 DMDの制御ソフトウェアにガボールフィルタバンクのスクリプトをロードする。 DMDのオンボードメモリにフィルタをバッファするためにスクリプト全体を実行し、これには数分かかることがあります。
2. スクリプト全体がバッファされると、我々は今、背景のフィルタ画像を取得することができます。 startを使用し、一度にガボールのようなフィルタに対応するフィルタのセットを1つだけをロードするためにDMDを指示するDMDソフトウェア内のマーカーを停止し、スクリプトを実行します。ライブ画像のプレビューは、そのフィルタのフィルタを適用したイメージに暗視野から変更すべきである。
3. ディスクからIPlabの取得スクリプトを開きます。信号の少なくとも2000カウントが取得されていることを保証するために露光時間を調整します。 DMDスクリプトが実行されているように、IPlabでライブプレビューをキャンセルして、買収のスクリプトを実行します。これは自動的に、取得するインデックスと、ディスクへのフィルタリングされた画像が保存されます。
4. 最初の画像が取得されると、DMDのソフトウェアで実行するスクリプトを停止し、スクリプトから使用されるコマンドを削除します。次のフィルタセットの開始時と終了時にスタートとストップマーカーを交換してください。 IPlabの買収を繰り返してください。
5. 全体フィルタバンクが使用されていると、すべてのフィルタ画像を取得し、保存されるまで手順3.4を繰り返します。

4。細胞をプレーティング

1. 今では、細胞はすぐに実験用プレートに準備されます。ラボのベンチ上にはんだごてのプラグイン。 37℃にL15の表示媒体と熱を取り除くペーパータオルやキムワイプでワークステーションを作る。キムワイプを引き裂くと駆け巡って、複数の灯芯を作る。芯がにと、セルプレートから液体を転送するのに役立つだろう。
2. この後、我々は、プレートのサンプルをする必要があります。我々は、間に金属板との"カバーのサンドイッチ"を作ること、プレートに我々の細胞を機械加工された金属のサンプルホルダを使用してください。各側の溝の端に半分ほど伸びる金属板の穴の上部周辺にシリンジから真空グリースの薄いビードを適用します。優しくきれいな無を押してください。グリース上に1スリップ。プレートを裏返し、穴の周囲にグリースを塗布してください。部屋の照明をオフにしてください。
3. 今、私たちは、70％エタノールで滅菌ニトリルの試験手袋でインキュベーターの内容を扱う、インキュベーターから細胞を得る。インキュベーターのドアが開いている間息を止めて、インキュベーターから細胞プレートを取り外します。部屋の光への曝露を最小限に抑えるように注意してください。
4. ウェル中にフェイスアップした側は、細胞が接続された側であることに注意し、6ウェルプレートから実験に使用されるカバーを取り外します。細胞を持ってカバースリップのどちら側のトラックを保持しながら、それは、ほぼ完全に乾燥するまで慎重に両側にカバースリップを乾燥させる。その後はエアギャップがグリースの層内に残っていないことを確認して、視野の穴に油を塗った金属板に、カバースリップ、ダウン細胞の側を押してください。グリースは、私たちはL15培地で細胞をロードするためにできるように防水シールを形成する必要があります。一度この特定のもの、上のバックプレートを反転させる。
5. 上部カバーと金属板との間の溝に液体を強制することにより、播種した細胞にL15培地をピペットで。うまく動作時に200μLをピペット。最初のボリュームのピペットは、ほぼ反対側の溝に延びる液体とカバーグラスの間に挟まれたスペースを埋めるようにするべき。
6. 播種した細胞に培地の別の200μLをピペットで、しかし、今回は、媒体が一方から他方に流れるように反対の木立で芯を保持します。これは、細胞を洗浄し、古い培地の痕跡を削除します。このステップの間に液体中に形成される気泡を防ぐために注意してください。このプロセスの各リンスの新しい芯を使用して2〜3回繰り返します。
7. 我々が差し込まはんだごてを覚えていますか？今はそれが使用される時間です。その液体が細胞の貯水池の中に閉じ込められ、ぽたぽた落ちることができないように端からプレートを支持する、もう一度逆さにプレートを反転します。 valapビーカーにはんだごてをつけます。これはすぐにその後、はんだごての先端にしがみつくでしょうvalapの一部を融解する。慎重に、アプリケータとしてコテを使用して底部カバー（現在は上向きに向いている）の周囲に溶融valapを適用します。金属板にカバースリップをシール、カバーの周囲のすべての方法を浸漬し、あなたが行くまでは適用を続行します。
8. ボトムカバーは、その上に成長する細胞があり、露出面上に乾燥までの媒体から残留物があるかもしれません。キムワイプとcleaninをはんだボールによってカバースリップの表面からあらゆる残留物をきれいに非常に客観的にクリーニングのような単一の滑り運動におけるgはカバースリップ。これは、カバースリップは、それが表示される中央にきれいであることを保証します。
9. はんだごてのプラグを抜き、同じ封じ込めと無菌の手順を観察するインキュベーターに6 - ウェルプレートを返します。ステップ2.4​​と2.5で説明されているように客観的で光学研究室とマウントに播種した細胞を取る。

5。実験を行っ

1. 健康そうな顔をしている細胞の素晴らしいフィールドを見つける。
2. 視野の暗視野像を取得する。微分干渉コントラスト（DIC）の顕微鏡の位置を合わせ、DIC画像を取得。露光時間は、その信号が十分であることを確認するために十分な長さであることを確認してください。
3. 今、私たちは他のカメラで蛍光画像を取得する必要があります。 CoolSnapにDIC画像を取得するには、我々はそれを交換し、必要に応じてそれを除去、復水器に接続されている青色LEDを使用してください。顕微鏡がまだDICに整列されている間、100％の両眼に等倍とビューポートに顕微鏡optovarを設定することにより、CoolSnapに光を送る。接眼レンズからカメラに画像をそらす。フィールドとプレビューRSimageのFOVを照らすと、必要に応じて細かいピントを調整するためにコンデンサーを介して、LEDを配置。 DIC画像を取得し、ディスクに保存します。 FOVは、カスケードのカメラから得られるものとは異なる方法に注意してください。これらのイメージは、実験後の解析フェーズ時に登録する必要があります。
4. フルオレセインfiltercubeにフィルターキューブを調整することにより、蛍光画像を取得します。簡単に顕微鏡を用いて蛍光励起をオンにして画像を取得してから、すぐに買収が完了すると、それをオフにしてください。我々はDICでサンプルを集中するので、蛍光画像も同様に焦点を当てています。これは、それによって光退色が遅く、蛍光の露光時間を節約できます。ディスクへの蛍光画像を保存します。
5. 今、私たちは、フィルタリングされた画像を取得する必要があります。暗視野顕微鏡をリセットして、2.9のようにLSMのポートを介して光を再送信。
6. 3.3から3.5のように全体のガボールフィルタバンクのスクリプトを実行します。我々は今一度ポイントのデータ取得を完了しました。

6。スタウロスポリン（STS）にセルを公開する培地を切り替え、および実験を通して培地を維持する

1. 細胞がまだステージにと視野を邪魔することなくであるが、DMSOのSTSの4mMのストック溶液から作られたSTSの1μM溶液を含む同じため、通常のL - 15培地を切り替えます。メディアを切り替えるためのステップ4.6で説明発散方法を使用してください。
2. 今、我々は、その後の時間ポイントのためのステップ5.2から5.6を繰り返します。実験が完了するまで、我々はこのプロセスを繰り返します。
3. 実験の過程で、より多くの媒体はサンプルが干からびるしないように追加する必要があります。これは、ステージから削除することなく、とFOVを邪魔することなく、セルプレートの木立に培地をピペッティングすることによって達成される。

7。代表的な結果

実験の終了時に、収集されたデータは、細胞内の構造データを抽出するために処理する必要のあるフィルタ画像が大量に含まれます。二つの例は、フィルタ期間S =0.95μm、ガウスエンベロープの標準偏差s = S / 2 =0.45μm、および方向Φ= 0 °〜Φ= 160 ° 20の9ガボールのようなフィルタで構成される光学フィルタバンクのために示されている°単位。 （[1]詳細についてはも参照してください）​​。

例1：海洋珪藻

まず、暗視野（DF）の画像（図1）ではっきりと表示されていた指向の機能を持つ海洋性珪藻のサンプル（キャロライナ生物供給会社）に私たちの姿勢に敏感なフィルタバンクを適用する。光学的にフィルタ処理された画像は、比較のために、サンプルのフィルタなしのイメージと一緒に表示されます。

図1：暗視野（DF）と海洋珪藻の光学的にフィルタ処理された画像。我々は、画像の右下（一番左のパネルに白い矢印）で珪藻を分析する。

珪藻の9ガボール-フィルタ画像のセットは、オブジェクト指向と丸みのため、ピクセル単位で処理した。処理は、（1）これにより、応答の重要性をエンコード信号応答の全体的な大きさを決定するために、各ピクセルでのすべての9つのガボールフィルタリングされた画像の測定した応答を加算し、（2）応答があるときのガボールフィルタの向き、Φを、見つけるの内訳最大化し、それによって、各ピクセルでのオブジェクトの選択配向を持っている範囲をエンコードするすべての角度の平均応答するために、この最大応答の比をとる。配向度は密接に粒子の幾何学的なアスペクト比に関係しています。図。 2B、目フィルタバンク（パラメータ1）と方向またはアスペクト比（パラメータ2）の度合いにピクセルの電子全体の応答はそれぞれ、色の彩度と色相でエンコードされています。大きい値（赤）がより高い優先回転角の応答が存在する領域を示す間、1（青）に近い縦横比は、どの優先応答の角度がないている地域に存在しています。部分構造の粒子の配向は、各行が密接にフィルタリングされていない暗視野（図2A）で表示される基本的なローカルオブジェクト指向と合意したquiverプロット（図2C）、にエンコードされます。

図2：：珪藻の暗視野像。 B：オブジェクト指向のイメージ。明るさが全体のガボールフィルタの応答の重要性をエンコードしながらカラースケールは、配向度（アスペクト比）を示している。 C：反応強度≥最大値の10％を持つオブジェクトの方向。線分は、対応する構造体の長軸を示している。

例2：アポトーシス細胞

ここでは、珪藻と同じ方法で処理されたスタウロスポリン（STS）で処理したウシ内皮細胞のフィルタ画像を表示。図。図3は、時刻Tで9フィルタ画像=- 180分と一緒に細胞のフィルタ処理されていない暗視野（DF）の画像を示しています。 STSの治療の前に。

図3：暗視野（DF）といくつかの生きて内皮細胞を含むフィールドの光学フィルタ画像。

フィルタリングされた画像は、その後、STS処理後3時間の間、20分毎に撮像した。図。 4aは時間の関数としてセルのアスペクト比のマップを示します。この場合、色の色相は図の色の色相と同様に配向度を（orientednessラベル）を表します。上記の図2b。しかし、アスペクト比の明るさは平均フィルタ応答によって重み付けされていませんでした。これらの細胞の標識ミトコンドリアの蛍光画像（図4b）とのアスペクト比のマップを登録することで、我々は、測定されたアスペクト比の低下はミトコンドリアを含む細胞の地域に限定されていると判断しで直接観察することができるミトコンドリアの断片化との併用だった同じ細胞の蛍光画像。図。 5は、アポトーシスを起こしている細胞で、時間の関数としてのアスペクト比の変化を描いた時間のプロットを示す。各セル内で、蛍光ミトコンドリアではなく、薄暗いバックグラウンド蛍光の領域に登録地域では登録地域でTにおけるアスペクト比の低下= 60〜100分がある。

図4：アスペクト比（a）と蛍光（B）アポトーシス誘導物質、スタウロスポリンで処理内皮細胞の画像。

図5：スタウロスポリンで処理内皮細胞における粒子のアスペクト比（orientedness）の減少を比較する時間プロット。個々のトレースは、単一細胞内時間プロットを表す。 orientednessの低下は、蛍光ミトコンドリア（左パネル）に登録する細胞の地域に限定し、残りのバックグラウンド蛍光の領域（右パネル）から不在です。

今我々はアスペクト比の低下はミトコンドリアの断片化に対応していることを、我々は、これらの細胞にアポトーシスを誘導する細胞を標識することなく、私たちの光散乱法を用いて断片化を測定し、この上の異なる遺伝的および実験条件の影響を調べることができると判断したダイナミック。

Discussion

方法は、例えば、粒子のサイズや向きをコード化することができるオブジェクトの収量形態学的地図上に記載。この構造情報は、いくつかの方法で使用することができます。

1. それは特定の治療中に変更され、さらに特定の分子と生化学的アッセイでこれらの領域を分析are組織または細胞領域を識別するために、初期画面として使用することができます。
2. それは、細胞内構造体（この方法による）の定量的特性を持つ分子の活性を同時に理解する（蛍光による）を結合した​​細胞のマルチモーダル歩留まり解析する蛍光と組み合わせて使用​​することができます。
3. 特定の構造物の応答が特定の生物学的プロセス（例えばアポトーシス）の特定のオルガネラ活性と相関されると、メソッドはこの構造応答に影響を与えるさまざまな遺伝的および実験条件のための画面への蛍光ラベルすることなく使用することができます。

これまでに我々は、メソッドが30 - 50nmの[2]オーダーの粒径の違いに敏感であることが示されている。我々は、メソッドが粒子の配向とアスペクト比の変化に敏感であることが示されている[3]とアポトーシス誘発性ミトコンドリアの断片化（上記の図4-5）と整合​​粒子のアスペクト比の減少に。

例2の結果は我々の手法は特定のオルガネラの機能の観点から解釈できると蛍光ラベルまたは外因性の染料なしで収集できる細胞機能の動的な測定を可能にすることを示唆している。しかし、具体的に標識された細胞小器官に対して測定された応答の最初の検証が必要でした。この最初の検証が完了すると、オルガネラダイナミクスは、私たちのラベルフリーメソッドで直接プローブすることができます。

複数の携帯電話の条件に法を適用し、セル内の異なる細胞内小器官の位置との動的構造の測定を相関させることは、我々は彼ミトコンドリアと同じように、最終的に一意に特定の細胞状態を特徴付けることができる動的構造挙動のライブラリにつながることができます（たとえばアポトーシス、酸化および代謝ストレス、炎症反応など）..この情報は、さらに臨床細胞解析の創薬などのさまざまなアプリケーションで使用することができる"セルの状態アナライザ"、に組み込むことができます。

ここで概説する方法は、顕微鏡イメージングシステムで取得した光学的散乱データは、特定の細胞内局在のダイナミクスを抽出するために使用できる一般的なアプローチを表すことに注意することは重要です。しかし、使用される特定のインストゥルメンテーションを大幅に向上させることができます。特に、空間フィルタリングのための空間光変調器の現在の選択は、データ収集、空間周波数の分解能、および光信号のスループットの効率を最大にする最適ではないことがあります。ここで使用されるデジタルマイクロミラーデバイスに関連付けられて色収差と幾何学的な異常が[3]で説明されています。我々は現在、これらの問題を緩和するためのDMDの代わりに最先端の液晶デバイスの潜在的な利点と欠点を検討している。さらに、データ収集、空間フィルタリングと顕微鏡の制御のための装置は、人間のユーザーによって別々に作動される。これは非常にフィルタ画像が大量に処理前に収集する必要が捕捉時間を制限します。このように、セットアップの自動化は、十分な信号対ノイズのために10のフィルタを通したイメージあたりのミリ秒に達すると予想されるCCDの露出、の持続時間と収集時間が見合うようにすることが不可欠です。時間分解能でのこの増加は、私たちは、より正確に生きている細胞内小器官の構造ダイナミクスを特徴づけることができます。そこで、積極的にハードウェアの制御を統一し、顕微鏡の制御、CCD画像の取得、および空間光変調器における光フィルタリングを含め、そのコンポーネントの作動を合理化できるカスタマイズされたグラフィックユーザーインターフェースの開発に取り組んでいます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen		Low glucose DMEM
Liebowitz L15 medium	Invitrogen		Without phenol red
L-glutamine	Invitrogen
Mitotracker Green	Invitrogen
Bovine Brain Extract	Clonetics
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products
Heparin	Sigma-Aldrich
Staurosporine	Sigma-Aldrich
Dymethylsulfoxide	Sigma-Aldrich
Inverted microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
DMD	Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD	Roper Scientific	Cascase 512B	High (16 bit) dynamic range CCD
CCD	Roper Scientific	Coolsnap cf