Summary
אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.
Abstract
קיפול פילמור חריגה של עמילואיד β (Aβ) פפטיד הוא חשב ליזום את מפל ניווניות בפתוגנזה מחלת אלצהיימר
Protocol
חלק 1: הכנת homogenates רקמות הבהיר
- Dounce homogenize רקמת קליפת המוח מבולבל בנפח פי 4 של חיץ קר כקרח (0.1M פוספט שנאגרו מלוחים [Ca + + - ו - Mg + + ללא] פלוס מעכבי 2x קוקטייל פרוטאז [סנטה קרוז]) עם כ -30 משיכות העלי אפילו (כלומר להוסיף למאגר 400μl לרקמות 100 מ"ג).
- Homogenates ספין במשך 5 דקות ב 3000 גרם (4 ° C). מוציאים בזהירות supernatants הבהיר ו aliquots חנות של תמציות אלה ב -80 ° C עד השימוש.
- קביעת ריכוז החלבון הכולל (מיקרוגרם / μl) עבור homogenates הבהיר באמצעות חומצה assay bicinchoninic (BCA), על פי הוראות היצרן (ThermoFisher).
חלק 2: SDS-PAGE הכנת המדגם
- עם 10 טוב, 10-20% Tricine ג'ל (Invitrogen), הנפח המקסימלי שניתן טעון גם הוא לכל ~ 25μl. נפח סך כולל 2x חיץ SDS מדגם סוכן הפחתת 10x, ולכן נפח מרבי של homogenate הבהיר כי ניתן לטעון גם הוא לכל 10μl. הבהרה 20% (w / v) homogenates קליפת המוח צריך ריכוז החלבון הכולל יותר מ 5 מיקרוגרם / μl, המאפשר לכל חלבון הכולל 50μg היטב. דוגמאות עם חלבון פחות 5mg/ml יחייב טעינה חלבון לכל מסך פחות טוב. עם זאת, רמות החלבון גבוהה אופטימלי לאיתור Aβ monomeric ו מצטברים (50 60μg חלבון הכולל הוא אופטימלי).
תמיד לטעון את אותה כמות של חלבון לכל מסך טוב. - עבור כל ג'ל, לטעון שלפחות אחד גם עם 10μl של סמן משקל מולקולרי כגון SeeBlue Plus2 (Invitrogen). כביקורת חיובית, לרוץ 10-100ng של Aβ40 סינתטי או Aβ42 פפטיד (בדילול מלא 1xPBS) היטב אחרת.
- הכנת תערובות תגובה על הקרח, באמצעות מופשר טרי, homogenates הבהיר. שפופרות וורטקס במשך 5-10 שניות, חום באמבט יבש ב 100 מעלות במשך 5 דקות, ולאחר מכן במהירות ספין כל דגימות כדי להסיר עיבוי בכובע.
חלק 3: SDS-PAGE ג'ל אלקטרופורזה
- טען דגימות vortexed על ג'ל Tricine 10-20% ב Gelbox בטח נעילת ה-Mini-Cell XCell, באמצעות Tricine חיץ SDS פועל על פי הוראות היצרן (Invitrogen),
- הפעל ג'ל במתח מתמיד של 125V למשך כ 90 דקות. תן דוגמאות לרוץ עד הלהקה סמן 4KDa הוא כ 1 ס"מ מהחלק התחתון של הג'ל.
חלק 4: העברת חלבונים מן ג'ל על ממברנות
- מוציאים בזהירות ממקרה ג'לים פלסטיק ולהרכיב את הכריך להעביר בתוך מודול II כתם XCell, על פי הוראות היצרן (Invitrogen). טרום רטוב סופג רפידות ממברנות nitrocellulose 0.2μm עם טריס-גליצין העברת חיץ (20% מתנול), ולהסיר כל הבועות מן רפידות סופג או כריך מסנן נייר / קרום.
- ב Gelbox XCell, למלא את התא הפנימי עם חיץ העברה למלא את התא החיצוני עם dIH 2 O (חשיפה מתנול יכול להתיש את gelbox פלסטיק לאורך זמן).
- הפעל את ההעברה עבור 2-3 שעות amperage מתמיד של 25mA.
- כאשר ההעברה תסתיים, לפרק את הכריך והמקום ג'ל לתוך dIH 2 O ו ממברנות לתוך 1xPBS, הן פלסטיק צלחות פטרי מרובע (או מיכל מתאים אחר).
- כדי להמחיש את יעילות העברת חלבון, ג'לים יכול להיות מוכתם SafeStain כחול פשוט (Invitrogen), ואת הקרומים עם כתם אדום Ponceau S (Sigma Aldrich), הן על פי הוראות היצרן. מכתים זה לא יפריע immunoblotting. אם מכתים מגלה העברת חלבון לא יעיל, לשנות זמן להעביר בשלב 3.
חלק 5. Antigen-epitope אחזור & Immunoblotting
- אחזור Antigen היא צעד חשוב לחשוף את epitopes Aβ על הממברנה עבור מחייב נוגדנים במהלך immunoblotting. כל קיטור, מיקרוגל, או מי האמבט השומרת על טמפרטורה קבועה של 100 מעלות צלזיוס יספיקו. לאחזור אנטיגן קיטור, חום לאטום את קרום בנרתיק Kapak הכבדות פלסטיק מלאים 1xPBS, בטמפרטורת החדר. הנח את שקיק שטוח קיטור מחומם מראש: פעם הכיס מתחיל להתרחב, דגירה של 15 דקות נוספות. אפשר הממברנה להתקרר לאט לפני הסרת אותו בכיס, כדי למנוע קמטים מוגזמת.
- בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את הקרום מן הכיס מהביל לשטוף את הממברנה במשך 5 דקות בתוך 1xPBS, ואחריו 5 דקות ולשטוף ב TBS-T (טריס שנאגרו pH מלוחים, עם 8.0% 0.05 Tween-20 [סיגמא] ), על שייקר מסלולית. דגירה הממברנה פתרון חסימה (חלב ללא שומן 2.5% ב TBS-T) למשך שעה אחת, רועדת. ללא שטיפה, העברת קרום לצלחת או נרתיק פלסטיק המכיל את הנוגדן העיקרי מדולל פתרון חסימה (6E10 על 1:1,000 [1μg/ml] 1:5,000 [0.2μg/ml] דילול, Covance), בועה הימנעותs. לדגור על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ואז 24-48 שעות רועד ב 4 ° C (הדגירה כבר יכול לתת איתות טוב יותר).
- יש לשטוף את הממברנה במשך 30 דקות ב TBS-T (אחד מהיר לשטוף ואחריו 3 x 10 שטיפות דקה).
- דגירה הממברנה של נוגדן HRP-מצומדות משני (Amersham ECL כבשים אנטי העכבר, GE Healthcare), מדולל ב 1:10,000 פתרון חסימה, במשך 90 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף את הממברנה במשך 30 דקות ב TBS-T (אחד מהיר לשטוף ואחריו 3 x 10 שטיפות דקה).
- על שייקר, דגירה הממברנה של טרי מתוצרת מגיב SuperSignal מערב פיקו Electrochemiluminescence (ThermoFisher) במשך 5 דקות, לספוג את עודפי מגיב על נייר מוך בחינם לסנן המקום קרום קלטת סרט, בין מגיני יריעת פלסטיק. את כתם נוסף מגיב SuperSignal עם אבק ללא Kimwipes במידת הצורך.
- לחשוף את הסרט Kodak MR Biomax עבור במרווחים של 30 שניות עד 30 דקות ולהתפתח מפתח בסרט. אחרי 5 דקות, להקות מונומר Aβ כנראה יהיה רווי.
- ממברנות יכול להיות חשוף (לאחר שטיפה ב TBS-T) על ידי רועדת שחזור פלוס הפשטת חיץ במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר reprobed עם נוגדנים נוספים אם תרצה בכך.
חלק 6: נציג Immunoblot:
דמויות 1a-c. Homogenates הבהרה 50μg המכיל חלבון הכולל 7 בבני אדם הם ניתחו את קיומו של Aβ multimeric APP ו. Immunoblotting עם 6E10 נוגדן מגלה מונומרים Aβ, הדימרים, trimers, tetramers ו APP (הלהקה למעלה) בכל המקרים אלצהיימר, כמו גם שפע גבוה משקל מולקולרי Aβ multimers ב 2 מקרים לספירה. סינתטי Aβ40 מאשרת את זהותו של להקות משקל מולקולרי נמוך. אלצהיימר: אלצהיימר, DLB: דמנציה עם גופיפי לואי, ND: אדם Nondemented (א) החשיפה הסרט 30 דקות, (ב) החשיפה הסרט 5 דקות, (ג) 30 חשיפה הסרט השני..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות החשיבות של צבירת Aβ בפתוגנזה של מחלת האלצהיימר 1,4,5, מחקרים מעטים תיארו או לכמת את התפלגות multimers Aβ מגוון אנושי דגימות רקמה קליפת המוח 2. טכניקות immunohistochemical בשימוש נפוץ שאינם מאפשרים אפליה של מינים שונים Aβ multimeric ברקמת קליפת המוח קבוע. בשנת מבולבל homogenates רקמת קליפת המוח, multimers Aβ ניתן להפריד ולהעריך ביוכימית באמצעות אלקטרופורזה בג'ל נוגדן מבוססי שיטות זיהוי. עם זאת, epitopes Aβ המוכוונות עשוי להיות מוסתר בתוך מבנים פפטיד מצטברים שונה שלאחר translationally, למנוע את זיהוי וכימות מדויק של Aβ מצטברים. באמצעות חום הנגרמת אנטיגן epitope שליפה בשילוב עם PAGE-SDS ו immunoblotting עם נוגדן לאזור N-הטרמינל של Aβ 6,7, אנו מסוגלים להפריד לזהות טבעי multimers Aβ שבודד מוחות אנושיים. אוכלוסיות נפרדות multimer Aβ ב homogenates רקמות הבהיר לאחר מכן ניתן לכימות על ידי צפיפות. בנוסף, השילוב של ג'ל או מיצוי-קרום עם Aβ immunoblotting יאפשר אפיון מבנית נוספת טבעי, שלאחר translationally שונה multimers Aβ מן הרקמה האנושית. זה יהיה חשוב כדי לקבוע אם multimers Aβ במוח האדם SDS עמידים, או אם הם SDS-רגיש שבור ולכן לתוך אגרגטים קטנים יותר על ידי SDS denaturation בתנאים מוגדרים. אפיון של צורות שונות של Aβ מצטברים במוח האנושי תאפשר את החיפוש אחר טיפולים סמנים למחלת אלצהיימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
תודות רבות איליין Pranski וקרולין Suwyn לקבלת סיוע טכני מעולה להארי לוין השלישי, מ 'פול מרפי, ומרלה תשלובת עבור שיחות חשובות. המימון ניתן על ידי RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, קרן Woodruff של אוניברסיטת אמורי ועדת המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma-Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
