Summary
De nauwkeurigheid en gevoeligheid van eiwit vaststelling door de snelle en handige Bradford assay in gevaar wordt gebracht door intrinsieke niet-lineariteit. We tonen een eenvoudige procedure die linearisatie verhoogt de nauwkeurigheid, verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, en vermindert de inmenging van wasmiddelen.
Abstract
Bepaling van de microgram hoeveelheden van eiwit in de Bradford Coomassie brilliant blue test wordt bereikt door het meten van absorptie bij 590 nm. Deze meest voorkomende test maakt een snelle en eenvoudige eiwitten kwantificering in cellysaten, cellulaire fracties, of recombinant eiwit samples, met het oog op normalisering van de biochemische metingen. Echter, een intrinsiek niet-lineariteit compromissen de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van deze methode. Er wordt aangetoond dat onder standaard testomstandigheden, de verhouding van de absorbantie metingen bij 590 nm en 450 nm is strikt lineair met eiwit concentratie. Deze eenvoudige procedure verhoogt de nauwkeurigheid en verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, waardoor de kwantificering tot 50 ng van runder serum albumine. Bovendien is de storing vaak geïntroduceerd door detergenten die gebruikt worden om de cellysaten creëren sterk verminderd door het nieuwe protocol. Een lineaire vergelijking ontwikkeld op basis van massa-actie en Beer de wet past perfect bij de experimentele data.
Protocol
Linearisatie van de Bradford Protein ijklijn:
De Coomassie briljant blauw eiwit assay, algemeen bekend als de Bradford assay 1, wordt op grote schaal gebruikt vanwege de snelle en handige protocol, alsook de relatieve gevoeligheid. Helaas is er een grote mate van kromming over een breed scala van proteïne concentraties (afb. 1). Daarom is slechts een beperkt aantal relatief hoge concentraties van eiwitten, 2-10 mg / ml BSA, gebruikt voor de kalibratie grafiek, die beter past dan lineaire regressie (afb. 1, groen). Echter, de niet-lineariteit vereist eiwit concentratie van de onbekende monsters te vallen binnen de beperkte bereik van de ijklijn om een grote fout te vermijden, en het vermindert ook de nauwkeurigheid van het beperkte bereik. De niet-lineariteit vormt een ernstig probleem in het bijzonder wanneer microgram hoeveelheden eiwit niet beschikbaar zijn, en het vereist vaak meerdere verdunningen van de onbekende monsters.
Zoals vermeld in de oorspronkelijke Bradford papier, "de bron van de niet-lineariteit is in het reagens zelf omdat er een overlap in het spectrum van de twee verschillende kleuren vormen van de kleurstof." 1. In feite drie vormen van de Coomassie briljante blauwe kleurstof worden in zuur-base evenwicht op de gebruikelijke zure pH-waarde van de test 2. De rode, blauwe en groene formulieren hebben absorptie maxima bij 470, 590, en 650 nm, respectievelijk (afb. 2). De blauwe is de vorm die het eiwit bindt, de vorming van een complex dat intens licht absorbeert bij 594 nm 3, 4 (afb. 2). Bradford merkte ook op dat "de achtergrond waarde voor het reagens steeds neemt af naarmate er meer kleurstof is gebonden aan eiwit" 1 (afb. 3). We daarom geprobeerd om de vermindering van de 590 nm achtergrond berekenen als toenemende hoeveelheden eiwit worden toegevoegd, door het meten van de verandering van de absorptie bij 450 nm, waar het eiwit-dye complex niet absorberen. We vonden dat de dalende achtergrond gedeeltelijk, maar niet volledig, is goed voor de niet-lineariteit (afb. 4).
Vervolgens hebben we de hypothese dat de daling in de vrije kleurstof concentratie een vervorming van de lineaire respons produceert, want zoals eiwit-dye binding in evenwicht is 5, complexvorming niet alleen afhankelijk van de concentratie van de vrije eiwit, maar ook op die van de vrije kleurstof (Fig. 5). Rekening houdend met zowel kwesties met betrekking tot de variabele concentratie van de kleurstof vrij, ontwikkelden we een wiskundige vergelijking die een lineair verband tussen eiwit-concentratie en de verhouding van absorptie metingen, 590 nm meer dan 450 nm (Fig. 6) beschrijft. Een gedetailleerde beschrijving van de theoretische en experimentele studie kunt u vinden in onze publicatie uit 1996 in Analytical Biochemistry 6. De wiskundige vergelijking was experimenteel getest en een lineaire kalibratiecurve over het gehele eiwitconcentraties bereik (Fig. 7) opleveren. Bovendien werd de vergelijking ook gevalideerd door een onafhankelijke bepaling van de juiste pH-afhankelijke waarde van de Y-as intercept 6.
Gedetailleerd protocol voor de verbeterde Bradford Protein Assay, met behulp van een Microplate Absorptie Reader:
- Bereid een 0,1 mg / ml stamoplossing van de standaard, bovine serum albumine. Een andere standaard kan worden gekozen, maar er rekening mee dat dezelfde norm moet worden gebruikt in alle experimenten.
- Verdun de onbekende monsters in gedeïoniseerd water. Streven naar 50 tot 50 ug / ml. Toch, hoger of lager eiwitconcentraties zijn aanvaardbaar, omdat er geen duidelijke grens voor de lineaire bereik van de test. Wel moet de meting worden in het lineaire bereik van de absorptie lezer.
- Verdun de Bradford reagens (Bio-Rad) 2,5-voudige in gedeïoniseerd water.
- Voeg 0 en 10-50 ul van BSA voorraad oplossing voor het drievoud putten (het creëren van een 0-5 microgram BSA kalibratie-curve). Aan te vullen met gedeïoniseerd water tot 100 ul bereik / goed.
- In verschillende bronnen, voeg 100 ul van onbekende monster in triplo. Verschillende concentraties van het onbekende monster kan worden gebruikt om de nauwkeurigheid te verhogen.
- Voeg 100 ul van de verdunde Bradford reagens aan alle putjes. Totale volume is 200 pl / well.
- Wacht tenminste 5 min, maar niet meer dan 60 minuten voor kleur ontwikkeling.
- De Blank moet 200 pl van gedeïoniseerd water (en niet de nul eiwit kleurstof goed) zijn.
- Meet de absorptie bij 590 nm en bij 450 nm.
- Maak een ijkgrafiek door de netto absorptie waarden bij 590 nm en bij 450 nm. Merk op dat de nul-eiwit (dye alleen) waarde moet worden opgenomen als een data punt (afb. 8).
- Bereken de concentratie van het onbekende monster op basis van de lineaire vergelijking van de ijklijn (Fig. 9).
Representatieve resultaten:
In tegenstelling tot de absorptie bij een golflengte van 590 nm, de verhouding van absorptiewaarden, 590 nm meer dan 450 nm, is lineair wet eiwitconcentratie (afb. 10).
Het eiwit concentratie van het onbekende monster kan eenvoudig worden berekend met behulp van lineaire vergelijking van de ijklijn (Fig. 10, vergelijking).
Het is echter een grotere nauwkeurigheid verkregen door het meten van een aantal onbekende monster verdunningen. Te dien einde, voor te bereiden twee grafieken. De eerste is een ijklijn voor de standaard met ug eiwit op de X-as (fig. 11, rechts). De tweede grafiek is voor het onbekende monster, met pi van het origineel onverdund monster op de X-as (fig. 11, links). De kleurstof enige waarde moeten worden opgenomen in beide grafieken (fig. 11). Het eiwit concentratie van het onbekende monster wordt verkregen door deling van de hellingen van het onbekende monster en de standaard (afb. 11, vergelijking).
Figuur 1. Conventionele Bradford ijklijn. Het lineaire bereik wordt vertegenwoordigd door groene symbolen.
Figuur 2. Spectra van het eiwit-dye complex en van de kleurstof alleen.
Figuur 3. Protein-dye evenwicht.
Figuur 4. Vermindering van de juiste berekende achtergrond vermindert gedeeltelijk niet-lineariteit.
Figuur 5. Protein-dye evenwicht.
Figuur 6. Wiskundige basis voor de linearisatie van de Bradford eiwit assay.
Figuur 7. Linearisatie van de Bradford ijklijn.
Figuur 8. Berekening van de Extinctieverhouding waarden.
Figuur 9. Een lineaire Bradford ijklijn.
Figuur 10. Linearisatie van de Bradford ijklijn.
Figuur 11. Onbekend monster-concentratie berekening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Bradford eiwit assay is populair vanwege het gemak van de prestaties en de relatieve gevoeligheid. De linearisatie over het gehele eiwitconcentraties assortiment verkregen door het protocol hier gepresenteerde verder de assay vereenvoudigd, zoals de onbekende monsters hoeven niet te vallen binnen het bereik van de ijklijn.
Belangrijk is dat de verbeterde protocol biedt verder de volgende voordelen ten opzichte van de oorspronkelijke Bradford protocol:
- Verhoogde nauwkeurigheid.
- De gevoeligheid wordt verhoogd met ongeveer een orde van grootte, waardoor het mogelijk is om zo weinig als 50 ng BSA in de microplaat assay 6 te bepalen.
- De verbeterde gevoeligheid mogelijk kwantificering eiwit in de aanwezigheid van detergenten. Met de originele Bradford protocol, zou de interferentie door detergenten normaal gesproken gebruikt voor cellysis vaak resulteren in een verminderde respons op eiwit. De verbetering van de gevoeligheid door een orde van grootte maakt verdunning van de monsters, met een punt waar de inmenging van detergenten wordt geëlimineerd. Houdt u er rekening mee dat de standaard monsters moeten dezelfde detergent samenstelling en concentratie bevatten, net als in de verdunde onbekende monsters.
De absorptie pieken van het eiwit-dye complex en de vrije rode kleurstof vormen zijn op 594 en 470 nm respectievelijk. Het wordt aanbevolen om de absorptie te meten bij 590 tot 600 nm, met de maximale gevoeligheid voor eiwitconcentratie verandering te bewerkstelligen, en op 450 tot 485 nm, te linearisatie te verzekeren.
Als gevolg van de optische weglengte overweging, kan een hogere nauwkeurigheid worden bereikt in een 1 ml test waar cuvetten worden geplaatst in een reguliere spectrofotometer, in plaats van een microplaat reader. In dat geval, schaal-up van de volumes 5-voudig.
Het is absoluut noodzakelijk dat gedemineraliseerd water wordt gebruikt als blanco. Een lineaire kalibratiecurve kan niet worden verkregen als de nul-eiwit standaard dye-bevattende monster wordt gebruikt als blanco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit document is gewijd aan de nagedachtenis van wijlen dr. Zvi Selinger, die gastheer van de originele onderzoek hier beschreven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | |
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
References
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).
