Summary
Судьба replisome после столкновения с лобовым РНК-полимераза (РНКП), неизвестно. Мы считаем, что replisome киосков при столкновении с передней частью РНКП, но возобновляется удлинения после перемещения РНКП с ДНК. MfD способствует репликации перезагрузки, облегчая перемещение РНКП после столкновения.
Abstract
В естественных условиях исследования показывают, что репликация вилки арестовали из-за столкновения с лобовым транскрипции комплексов. Тем не менее, судьба replisome и РНК-полимераза (РНКП) после лобового столкновения, неизвестно. Здесь мы находим, что E. кишечной replisome киосков при столкновении с передней частью транскрипции комплекс, но вместо того, рушится, репликации вилка остается весьма стабильным и в конце концов возобновляет удлинения после перемещения РНКП с ДНК. Мы также обнаружили, что транскрипции ремонтно-коэффициент связи, МФД, способствует прямое перезапуск вилки при столкновении, облегчая перемещение РНКП. Эти результаты показывают, внутренняя стабильность репликации аппарата и новые роли для транскрипции связью ремонт пути в продвижении репликации прошлом РНКП блока.
Protocol
Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Померанц и О'Доннелл, 327 Наука, 590-592 (2010) .
1. Ассамблея остановилась комплекс удлинение РНКП была выполнена следующим образом:
500 нМ конечная концентрация E. кишечной РНКП σ 70 HE смешивали с 5 нМ конечная концентрация биотинилированного 3,6 кб ДНК шаблон, содержащий T7A1 промоутер в 100 мкл буфера (20 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 8 мМ MgCl 2, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT, 10% глицерина) в течение 10 минут при температуре 37 ° C. 100 мкМ ВСУ и 40 мкМ каждого из ГТФ, АТФ и CTP были добавлены в течение дополнительных 10 минут при температуре 37 ° C.
2. Иммобилизация остановился комплекса РНКП на удлинение бисером стрептавидин проводился следующим образом:
200 мкл стрептавидином магнитных покрытием шариков (Invitrogen) были добавлены к реакции выше в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Очистка иммобилизованных остановился комплекс удлинение РНКП была выполнена следующим образом:
Шариков (сверху) промывают 5 раз с 0,9 мл буфера А, содержащего 0,75 М NaCl, 200 мкг / мл гепарина и 20 мкг / мл оцДНК (супернатант удален после каждого мытья шаг за магнитной сепарации.) Далее, бисер промывали 2 раза с 0,9 мл буфера А.
4. Формирование репликации вилки вниз по отношению к лобовым РНКП была выполнена следующим образом:
Шариков (сверху) ресуспендировали в 100 мкл Новой Англии Биолабс буфер 4 и 10 единиц Сап I (New England Biolabs) был добавлен в течение 10 мин при 37 ° C. Бисер промывали 3 раза с 0,9 мл буфера, а затем ресуспендировали в 50 мкл буфера быстрого Т4 реакции лигирования (Новая Англия Биолабс). 2 мкл Быстрый лигазы Т4 (Новая Англия Биолабс) была добавлена вместе с 6 нМ конечная концентрация предварительно отожженных раздвоенной ДНК (RP10, RP22, RP25) в течение 10 мин при комнатной температуре. Бисер промывали 3 раза с 0,9 мл буфера А.
5. Ассамблея replisome и начало синтеза ведущей нити на вилке репликации была выполнена следующим образом:
448 пмоль DnaB (как гексамера) инкубировали с бисером 150 мкл буфера (20 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 8 мМ MgCl 2, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT, 10% глицерина) в течение 30 с при 23 ° C. 4,9 пмоль Pol III * (Pol III HE минус β), 15 пмоль β, 2 мМ АТР и 60 мкМ каждого из дГТФ и дАТФ были добавлены в объеме 200 мкл и инкубировали еще 5 минут при температуре 37 ° C. Репликация было возбуждено по добавлением 10 мкг SSB и 24 мкМ каждого из дАТФ и dTTP вместе с [α-32 P] dTTP и [α-32 P] дЦТФ (специфическая активность, 3000-5000 копий в минуту / пмоль) до конечного объема 250 мкл. Реакции были прекращены через 10 мин после добавления 12 мкл 500 мМ ЭДТА.
6. Очистка и концентрация радиоактивной меткой продукция ДНК осуществляется следующим образом:
Шариков (сверху) варили после реакции было прекращено, чтобы удалить ДНК из бисера. Любой остаточной ДНК остаются прикрепленными к бисером удаляли лечения бисер с протеиназы К в объеме 10 мкл в течение 30 мин при 50 ° C. Затем шарики вареных и супернатант удаляли магнитной сепарации. Комбинированный супернатант, содержащий ДНК очищали с использованием ПЦР Qiagen Очистка комплект. Очищенная с радиоактивной меткой продукты ДНК были затем проанализированы в щелочном агарозном геле.
* Репликации в отсутствие лобового РНКП остановился удлинение комплекса было выполнено, что и выше, однако, σ 70 был опущен.
Представитель Результаты:
Столкновение replisome с лобового РНКП обычно приводит двух продуктов в 2,5 кб и 3,6 кб в длину. 2,5 кб продукт представляет длина ДНК из вилки остановился РНКП и результаты replisome сваливания при столкновении с РНКП. 3,6 кб продукта представляют полнометражный ДНК и результатов либо неполной занятости из промотора РНКП или частичное replisome чтения через головы-на РНКП. Хорошее или точный результат показывает, что примерно 50% от полной длины ДНК производится. Тем не менее, в некоторых случаях меньше занятость промотора РНКП происходит, и более высокий процент полнометражный ДНК наблюдается с большим населением replisomes не сталкиваются в лоб РНКП. Репликация в отсутствие остановился РНКП результаты только в полнометражных ДНК (3,6 кб).
Рис. 1 replisome мешает лобовое РНКП.
(А) экспериментальной установки. E. ColРНКП я остановился удлинение комплекса была собрана на биотинилированного ДНК, содержащей T7A1 промоутер, как описано выше (9). Короче говоря, остановить удлинение комплекса была сформирована 20 бит вниз по течению от промоутера путем инкубации РНКП холофермента с биотинилированного ДНК в течение 10 мин с последующим добавлением в ВСУ, ГТФ, АТФ и CTP в течение еще 10 мин. Стрептавидином шарики добавлены дополнительные 10 минут, затем бисер промывали пять раз с 0,9 мл буфера, содержащего 0,75 NaCl, 200 мг / мл гепарина и 100 нМ однонитевые ДНК, чтобы удалить неустойчивой РНКП-ДНК и избыточную НПТ . ДНК затем переваривают SAPI, промывают, и лигировали с предварительно отожженных раздвоенной ДНК. Бисер промывали вновь до сборки replisome. Промоутер находится в 2,5 кб из вилки и ориентирована на прямую транскрипцию к вилке. (B) DnaB был добавлен затем replisome был собран и репликации был инициирован либо в присутствии (дорожка 2) или отсутствие (дорожка 1), лобового РНКП.
Disclosures
Стиральная остановился удлинение комплекса связана с бисером с высоким содержанием соли имеет решающее значение для того, чтобы удалить любые нестабильные или неспецифически связанных молекул РНКП. РНКП имеет чрезвычайно высокое сродство к праймер-шаблон структур типа ДНК. Таким образом, необходимо, чтобы удалить такие неспецифические РНКП-ДНК для того, чтобы выполнять репликацию с грунтовкой-шаблона. Концентрация радиоактивной меткой ДНК продукции с использованием очистки ПЦР Qiagen комплект также имеет важное значение для того, чтобы получить достаточно высокий радиоактивный сигнал, который можно наблюдать в гель.
Acknowledgments
Мы особенно благодарны Сет Дарст за предоставление РНКП и МФУ белков и векторов экспрессии. Мы также благодарим Сергея Борухов за предоставление Греб и Дан Чжан технической поддержки. Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (MOD) и Мари-Жозе и Генри Kravis стипендий в Университете Рокфеллера (RTP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M-270 | Invitrogen | 653.05 | |
| SapI | New England Biolabs | R0569S | |
| T4 Quick Ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
- Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
- Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
- McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
- Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
- Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
- Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
- Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
- Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
- Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
- Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
- Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
- Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
- George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).
