Summary
Bir çarpışma replisome kaderi ile baş-RNA polimeraz (RNAP) bilinmiyor. Biz DNA RNAP yerinden sonra uzama replisome baş RNAP ile çarpışması üzerine tezgahları, ancak devam eder ki bulabilirsiniz. MFD çarpışmadan sonra RNAP yerinden kolaylaştırarak çoğaltma işlemini yeniden başlatın teşvik etmektedir.
Abstract
In vivo çalışmalarda çoğaltma çatal ile baş-transkripsiyon kompleksleri nedeniyle karşılaşmalar tutuklandı olduğunu düşündürmektedir. Ancak, replisome ve RNA polimeraz (RNAP) kaderi şu kafa kafaya çarpışmada bilinmiyor. Burada bulduğumuz E. replisome tezgahları ile çarpışması üzerine coli baş-transkripsiyon kompleksi, ama yerine çöken, çoğaltma çatal son derece kararlı kalır ve sonunda DNA RNAP yerinden sonra uzama devam eder. Biz transkripsiyon-onarım bağlantı faktörü, MFD, çatal RNAP yerinden kolaylaştırarak çarpışma sonucu doğrudan yeniden teşvik olduğunu da bulabilirsiniz. Bu bulgular içsel istikrar ve çoğaltma cihazı RNAP blok geçmiş çoğaltma teşvik transkripsiyon birleştiğinde onarım yolu için yeni bir rol göstermektedir.
Protocol
Bu yöntem bildirilen araştırmada kullanılan Pomerantz ve O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) .
1. Durdurulmuş RNAP uzama kompleksi Meclisi şu şekilde yapıldı:
E. 500 nM nihai konsantrasyonu coli RNAP HE 100 A (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 tampon ul T7A1 organizatörü içeren bir biotinlenmiş 3.6 kb DNA örneğinin 5 nM nihai konsantrasyonu ile karışık 70 σ 10 dk 37 mM DTT,% 10 gliserol) ° C. APU ve her biri 40 mcM, GTP, ATP ve CTP 100 mcM 37 ek bir 10 dakika ° C eklendi
2. Streptavidin boncuk üzerine durduruldu RNAP uzama kompleksi immobilizasyonu şu şekilde yapıldı:
200 ul streptavidin kaplı manyetik boncuk (Invitrogen) Yukarıdaki reaksiyon oda sıcaklığında 10 dakika ilave edildi.
3. Immobilize durduruldu RNAP uzama kompleksi Arıtma şu şekilde yapıldı:
Boncuk tampon 0.9 ml A içeren 0.75 M NaCl, 200 mg / ml heparin ve 20 mg / ml Sonraki ssDNA (süpernatant manyetik ayırma her yıkama adımdan sonra kaldırıldı.), (Yukarıda) ile 5 kez yıkandı boncuk, 2 kez 0.9 ml tampon A. ile yıkandı
4. Baş-on RNAP şu şekilde yapılmıştır downstream göreceli bir replikasyon çatal Oluşumu
° C, boncuk (yukarıda) New England Biolabs tampon 4 ve Sap (New England Biolabs) 10 adet 100 ul yeniden süspanse 37 10 dakika eklendi. Boncuk 0.9 ml tampon A ile 3 kez yıkanır ve ardından Hızlı T4 ligasyon reaksiyon tamponu (New England Biolabs) 50 ul yeniden süspanse edildi. Hızlı T4 ligaz (New England Biolabs) 2 ul oda sıcaklığında 10 dakika için ön tav-çatallı DNA 6 nM final konsantrasyonu (RP10, RP22, RP25) ile birlikte eklendi. Boncuk 0.9 ml tampon A. ile 3 kez yıkandı
5. Çoğaltma çatal önde gelen iplikçik sentez replisome ve inisiyasyon Kurul şu şekilde yapıldı:
Tampon boncuk 150 ul 448 pmol DnaB (hexamer gibi) ile inkübe edildi (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT,% 10 gliserol) az 30 s 23 ° C Pol III 4.9 pmol * (Pol III HE eksi β), 15 pmol β, 2 mM ATP ve her biri 60 mcM dGTP ve dATP hacmi 200 ul eklenir ve 37 az bir 5 dakika daha ° C inkübe edildi Çoğaltma ile birlikte 10 mg SSB ve her biri 24 mcM dATP ve dTTP ekleyerek üzerine başlatılan [α-32 P] dTTP ve [α-32 P] dCTP (spesifik aktivite, 3.000-5.000 cpm / pmol) son hacmi 250 mcL. Reaksiyonları 12 ul 500 mM EDTA ekleyerek üzerine 10 dakika sonra sona erdirildi.
6. Arıtma ve radyo-işaretli DNA ürünlerin konsantrasyonu şu şekilde yapıldı:
Reaksiyon boncuk DNA kaldırmak için sona erdirildi sonra boncuk (yukarıda) kaynatılır. 50 - 30 dk 10 ul hacmi proteinaz K ile boncuk tedavi ° C boncuklar bağlı kalan herhangi bir kalıntı DNA tarafından kaldırıldı Boncuk sonra kaynatılmış ve manyetik ayırma süpernatantı tarafından kaldırıldı. DNA içeren kombine süpernatant Qiagen PCR Temizleme kiti kullanarak saflaştırılmış. Saf radyo-işaretli DNA ürünleri daha sonra alkali agaroz jel analiz edildi.
* Baş RNAP uzama kompleksi yukarıdaki gibi yapıldı durdurdu, ancak σ 70 yokluğunda Çoğaltma atlandı.
Temsilcisi Sonuçlar:
Çarpışma ile replisome bir baş-RNAP genellikle 2,5 kb ve uzunluğu 3,6 kb iki ürün ile sonuçlanır. 2,5 kb ürün durduruldu RNAP ve RNAP ile çarpışması üzerine durdurduklarını replisome sonuçları çatal DNA uzunluğu temsil eder. 3.6 kb ürün eksik RNAP organizatörü doluluk veya kısmi replisome baş RNAP salt yoluyla tam uzunlukta DNA ve sonuçları temsil eder. Iyi ya da doğru bir sonucu, yaklaşık% 50 tam uzunlukta DNA olduğunu göstermektedir. Ancak, bazı durumlarda RNAP organizatörü az doluluk oluşur ve daha yüksek bir yüzdesi tam uzunlukta DNA replisomes daha büyük bir nüfus beri gözlemlenen bir baş-RNAP karşılaşma yok. Sadece tam uzunlukta DNA (3.6 kb) durduruldu RNAP sonuçları yokluğunda Çoğaltma.
Şekil. 1 replisome baş RNAP engellemektedir.
(A) Deneysel kurulum. A E. coli RNAP durduruldu uzama kompleks, daha önce açıklandığı gibi T7A1 organizatörü (9) içeren bir biotinlenmiş DNA üzerine monte edildi . Kısaca, durdurulmuş bir uzama kompleksi APU, GTP, ATP ve CTP bir 10 dakika daha ilave edilerek 10 dakika için biotinlenmiş DNA ile RNAP holoenzyme kuluçka organizatörü 20 bps downstream kuruldu. Streptavidin boncuk boncuk 0.75 m NaCl, 200 mg / ml heparin içeren ve 100 nM tek iplikli DNA kararsız RNAP-DNA kompleksleri ve aşırı UTP'larının kaldırmak için 0.9 ml tampon beş kez yıkandı ek bir 10 dakika ilave edildi . DNA sonra Sapi ile sindirilmiş, yıkanmış ve bir ön tav-çatallı DNA bağlandı oldu. Boncuk replisome montaj öncesinde tekrar yıkandı. (B) DnaB sonra replisome toplandı eklendi ve çoğaltma ya varlığında başlatılan (şeritli 2) veya yokluğu (şeritli 1) organizatörü çatal 2,5 kb bulunan ve çatal yönelik doğrudan transkripsiyon yönelik. baş üzerinde RNAP.
Disclosures
Çamaşır durduruldu uzama kompleksi yüksek tuz ile boncuklar bağlı herhangi bir dengesiz veya non-spesifik bağlı RNAP molekülleri kaldırmak için kritik öneme sahiptir. RNAP astar şablon türü DNA yapıları için son derece yüksek bir afinitesi vardır. Bu nedenle, astar şablon çoğaltma gerçekleştirmek için, non-spesifik RNAP-DNA kompleksleri kaldırmak için gereklidir. Qiagen PCR saflaştırma kiti kullanılarak, radyo-işaretli DNA ürünler Yoğunlaştırmalı jel görülebilir, yeterince yüksek bir radyoaktif sinyal elde etmek için de kritik öneme sahiptir.
Acknowledgments
Biz Seth Darst RNAP ve MFD proteinler ve ifade vektörleri sağlamak için özellikle teşekkür ediyoruz. Ayrıca, teknik destek Greb ve Dan Zhang sağlamak için Sergei Borukhov teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Sağlık (MOD) National Institutes hibe ve Marie-josee ve Rockefeller Üniversitesi (RTP) Henry Kravis Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M-270 | Invitrogen | 653.05 | |
| SapI | New England Biolabs | R0569S | |
| T4 Quick Ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
- Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
- Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
- McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
- Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
- Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
- Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
- Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
- Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
- Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
- Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
- Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
- Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
- George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).
