Summary
Den öde replisome efter en kollision med ett huvud-på RNA-polymeras (RNAP) är okänd. Vi finner att replisome bås vid kollision med ett rakt på RNAP, men återupptas töjning efter förskjuts RNAP från DNA. MFD främjar replikering starta genom att underlätta förskjutning av RNAP efter kollisionen.
Abstract
In vivo-studier tyder på att replikering gafflar arresteras på grund av möten med head-on transkription komplex. Men ödet för de replisome och RNA-polymeras (RNAP) efter en frontalkrock är okänd. Här finner vi att E. coli replisome bås vid kollision med ett rakt på transkription komplex, men istället för att kollapsa, förblir replikationsgaffeln mycket stabila och så småningom återgår töjning efter förskjuts RNAP från DNA. Vi finner också att transkription-reparation kopplingsfaktor, multifunktionsmaskin främjar direkt omstart av gaffeln efter kollisionen genom att underlätta förskjutning av RNAP. Dessa resultat visar på inneboende stabilitet replikering apparater och en ny roll för transkription-kopplade reparation väg att främja replikering förbi en RNAP block.
Protocol
Denna metod användes i forskningen redovisas i Pomerantz och O'Donnell, 327 Vetenskap, 590-592 (2010) .
1. Montering av ett stoppades RNAP förlängning komplex utfördes enligt följande:
500 nm slutlig koncentration av E. coli RNAP σ 70 HE var blandad med 5 nM slutlig koncentration av ett biotinylerad 3,6 kb DNA-mall som innehåller T7A1 promotor i 100 l av buffert A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mm MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) i 10 min vid 37 ° C. 100 mikroM av Apu och 40 mikroM var och en av GTP, ATP och CTP lades ytterligare 10 minuter vid 37 ° C.
2. Fixering av stoppades RNAP töjning komplex på streptavidin pärlor utfördes enligt följande:
200 ìl streptavidin magnetiska belagda kulor (Invitrogen) lades till reaktionen ovan för 10 min vid rumstemp.
3. Rening av stoppades immobiliserade RNAP töjning komplex utfördes enligt följande:
Kulorna (från ovan) spolades 5 gånger med 0,9 ml av buffert A som innehåller 0,75 M NaCl, 200 mikrogram / ml heparin och 20 mikrogram / ml ssDNA (Supernatanten togs bort efter varje tvätt steg för magnetisk separering.) Nästa, den pärlor spolades 2 gånger med 0,9 ml buffert A.
4. Bildande av ett replikationsgaffeln nedströms i förhållande till huvud-på RNAP utfördes enligt följande:
Kulorna (från ovan) var återsuspenderade i 100 l av New England Biolabs buffert 4 och 10 enheter av Sap I (New England Biolabs) lades i 10 min vid 37 ° C. Kulorna spolades 3 gånger med 0,9 ml av buffert A och sedan suspenderade i 50 ìl Quick T4 Ligation reaktion buffert (New England Biolabs). 2 ìl av Quick T4 ligas (New England Biolabs) inkom tillsammans med 6 nM slutlig koncentration av pre-glödgat kluven DNA (RP10, RP22, RP25) i 10 min vid rumstemp. Kulorna spolades 3 gånger med 0,9 ml buffert A.
5. Montering av replisome och initiering av ledande strand syntes på replikationsgaffeln utfördes enligt följande:
448 pmol av DnaB (som hexamer) var inkuberas med pärlor 150 l av buffert A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mm MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mm DTT, 10% glycerol) i 30 s vid 23 ° C. 4,9 pmol av Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol av β, 2 mm ATP och 60 mikroM varje dGTP och dATP lades till en volym av 200 l och inkuberas ytterligare 5 minuter vid 37 ° C. Replikering inleddes efter att lägga till 10 mikrogram SSB och 24 mikroM varje dATP och dTTP tillsammans med [α-32 P] dTTP och [α-32 P] dCTP (specifik verksamhet, 3,000-5,000 CPM / pmol) till en slutlig volym på 250 mikroliter. Reaktionerna upphörde efter 10 min på att lägga 12 ìl av 500 mM EDTA.
6. Rening och koncentrationen av radioaktivt märkt DNA-produkter utfördes enligt följande:
Kulorna (från ovan) var kokt efter reaktion avslutades i syfte att ta bort DNA från pärlor. Eventuella kvarvarande DNA som kvarblir bifogas pärlor togs bort genom att behandla det pärlor med proteinas K i en volym av 10 ul i 30 minuter vid 50 ° C. Kulorna var sedan kokas och supernatanten togs bort genom magnetisk separation. Den kombinerade supernatanten innehållande DNA renas med hjälp av Qiagen PCR Cleanup kit. Renat radioaktivt märkt DNA-produkter sedan har analyserats i en alkalisk agarosgel.
* Replikering i avsaknad av ett huvud-på RNAP stannade töjning komplex utfördes som ovan, men σ 70 utelämnats.
Representativa resultat:
Kollision av replisome med ett huvud-på RNAP oftast resulterar i två produkter på 2,5 kb och 3,6 kb i längd. Den 2,5 kb produkt är längden på DNA från gaffeln till stoppats RNAP och resultat från replisome stannat vid kollision med RNAP. Den 3,6 kb Produkten representerar full längd DNA och resultat från antingen ofullständig beläggning arrangören av RNAP eller delvis replisome genomläsning av huvudet-på RNAP. En bra eller korrekt resultat visar att ca 50% full längd DNA produceras. Men i vissa fall mindre beläggning arrangören av RNAP inträffar och en högre andel av full längd DNA följs eftersom en större population av replisomes möter inte en head-on RNAP. Replikering i avsaknad av ett stoppades RNAP resultat bara full längd DNA (3,6 kb).
Figur. 1 Den replisome hämmas av ett huvud-på RNAP.
(A) experiment. En E. colJag RNAP stannade töjning komplex var monterad på en biotinylerad DNA innehåller T7A1 promotor som tidigare beskrivits (9). Kortfattat var ett stoppades förlängning komplex bildas 20 bps nedströms från arrangören genom inkubering RNAP holoenzyme med biotinylerad DNA i 10 minuter följt av tillsats av APU, GTP, ATP och CTP i ytterligare 10 min. Streptavidin pärlor lades ytterligare 10 min sedan kulorna spolades fem gånger med vardera 0,9 ml buffert som innehåller 0,75 m NaCl, 200 mg / ml heparin och 100 nM enda DNA för att ta bort instabil RNAP-DNA-komplex och överskott NTPs . Det DNA var då kokas med Sapi, tvättade och knyts ihop till en i förväg glödgat kluven DNA. Kulorna spolades igen före monteringen av replisome. Arrangören ligger 2,5 kb från gaffeln och är inriktad på direkt transkription mot gaffeln. (B) DnaB lades då replisome var församlad och replikering inleddes antingen i närvaro (Lane 2) eller frånvaron (Lane 1) av en rakt på RNAP.
Disclosures
Tvätta stannade töjning komplexet bundna till pärlor med hög salt är avgörande för att undanröja instabil eller icke-specifikt bundet RNAP molekyler. RNAP har en extremt hög affinitet för primer-template strukturer typ DNA. Därför är det nödvändigt att avlägsna sådana icke-specifika RNAP-DNA-komplex för att kunna utföra replikering från primer-mall. Inriktning av radioaktivt märkta DNA produkter med hjälp av Qiagen PCR rening kit är också kritisk för att få en tillräckligt hög radioaktiv signal som kan observeras i gelen.
Acknowledgments
Vi är särskilt tacksamma mot Seth Darst för att ge RNAP och MFD proteiner och vektorer uttryck. Vi tackar även Sergei Borukhov för att ge Greb och Dan Zhang för teknisk support. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (MOD) och av en Marie-Josée och Henry Kravis Fellowship vid Rockefeller University (RTP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M-270 | Invitrogen | 653.05 | |
| SapI | New England Biolabs | R0569S | |
| T4 Quick Ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
- Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
- Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
- McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
- Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
- Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
- Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
- Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
- Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
- Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
- Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
- Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
- Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
- George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).
