Summary
Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).
Abstract
Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser Spettrometria di Massa desorbimento ionizzazione (MALDI-MS) 1, 2. L'ultra-sottile strato metodo comporta la produzione di un substrato di cristalli di matrice (alfa-ciano-4-acido idrossicinnamici) sulla piastra del campione, che serve come terreno per la semina successiva cristallizzazione di una matrice / analita miscela. I vantaggi del metodo ultra-sottile strato rispetto ad altri approcci deposizione del campione (ad esempio delle gocce essiccate) sono che offre (i) maggiore tolleranza alle impurità come i sali e detergenti, (ii) la migliore risoluzione, e (iii) maggiore uniformità spaziale. Questo metodo è particolarmente utile per la determinazione della massa accurata delle proteine. Il protocollo è stato inizialmente sviluppato ed ottimizzato per l'analisi delle proteine di membrana e utilizzato per analizzare con successo i canali ionici, trasportatori metabolita, e recettori, contenente tra 2 e 12 domini transmembrana 2. Dopo la pubblicazione originale, ma ha anche dimostrato di essere ugualmente utile per l'analisi di proteine solubili. Anzi, lo abbiamo usato per un gran numero di proteine che hanno una vasta gamma di proprietà, compresi quelli con peso molecolare alto come 380 kDa 3. Oggi è il nostro metodo di scelta per l'analisi molecolare di massa di tutte le proteine. La procedura descritta produce costantemente spettri di alta qualità, ed è sensibile, robusto e facile da implementare.
Protocol
E 'molto importante indossare guanti privi di polvere durante la preparazione dello strato sottile.
Pulizia della piastra del campione
- Utilizzare un acciaio inossidabile placcata in oro o campione MALDI.
- Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe. Non strofinare o strofinare la superficie con il Kimwipe, per evitare di graffiare la superficie.
- Lavare con H 2 O e strofinare delicatamente con un Kimwipe.
- Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe.
- Se necessario, ripetere MeOH / H 2 O / MeOH ciclo di pulizia, sempre che termina con MeOH.
- Assicurarsi che non ci sono punti fantasma o residuo rimasto sul piatto. Se ci sono macchie fantasma, lavare la piastra con acqua deionizzata, mentre strofinando la superficie con la mano guantata (Non strofinare con Kimwipes). Ripetere la MeOH / H 2 O / MeOH ciclo di pulizia.
- Utilizzare la piastra subito dopo il lavaggio.
Preparazione della soluzione sottile strato di substrato
- Mescolare 1 parte di saturi 4-HCCA (2 parti ACN, 1 parte di acqua, e lo 0,1% finale TFA) e 3 parti di isopropanolo.
Nota: Il sottile strato di soluzione di substrato è molto stabile, e può essere conservato a temperatura ambiente al buio per un anno. Può anche essere conservato a 4 ° C.
Fare il substrato sottile strato
- Applicare 20-50μL della soluzione di substrato sottile strato di sinistra-centro del piatto, e si diffondono con il lato di un puntale. Raccogliere in una direzione.
- Come si asciuga soluzione, il solvente evapora organico molto rapidamente, lasciando dietro di piccolissime gocce d'acqua sulla superficie della piastra. A questo punto, avvolgere il dito indice con una strato di Kimwipe e inizialmente leggermente asciugare la superficie della piastra con esso.
- Quando la superficie è liberato da goccioline d'acqua, pulire l'intera piastra con movimenti ampi uni-direzionale con un Kimwipe.
Nota: Se la soluzione non si diffonde a sufficienza per tutta la superficie della piastra, aumentare la composizione ACN e ricreare lo strato sottile. Alcuni parametri che possono influenzare la diffusione della soluzione comprendono umidità e temperatura.
Nota: con tavole d'oro, lo strato di solito appare come un riflesso giallastro, a seconda della luce e angoli di visione. Con piastre in acciaio, ma solo il bordo dello strato è normalmente visibile. - Pulire i bordi del piatto con un Kimwipe fresca prima di inserirlo nel porta targa per evitare matrice di contaminare lo strumento.
Preparazione della soluzione di matrice
- Saturi 4-HCCA in FWI (3 parti di acido formico, 1 parte di acqua, 2 parti di isopropanolo) è consigliato per l'analisi di entrambe le membrane e proteine solubili. Potrebbe anche essere usato in casi particolari per l'analisi di peptidi di grandi dimensioni molto idrofobiche (M> 4000 U). Assicurarsi che la soluzione matrice utilizzata per individuare le proteine non superi il 50% ~ contenuto organico, in quanto completamente sciogliere il substrato sottile strato, sconfiggendo i vantaggi del metodo.
Prova del substrato sottile strato
- 0.5μL posto della soluzione di matrice sul piatto. Un precipitato biancastro apparirà l'interfaccia tra lo strato sottile e la goccia. Quando questo strato copre la parte inferiore della goccia interamente, di solito entro 10-15 secondi, aspirare il liquido in eccesso con una linea a vuoto. Se passano più di 30 secondi per il precipitato di forma, è l'indicazione che ci potrebbe essere un problema con il substrato sottile strato e / o la soluzione matrice.
Esempio di applicazione
- La concentrazione di analita nella soluzione di partenza dovrebbe essere entro 10 e 1000μM.
- Diluire la soluzione di analita in soluzione matrice ad una concentrazione di analiti finale tra 0,2 e 2μM. Per esempio, iniziare con 1ml di campione e di soluzione 9μl matrice.
Nota: Assicurarsi che la matrice è vicino alla saturazione nella soluzione finale, altrimenti si ridisciogliere il substrato sottile strato.
Nota: le concentrazioni Analita necessari per ottenere segnali decente sono altamente dipendenti dalla complessità della soluzione e la composizione (ad esempio, contaminanti) e ionizability analita.
Nota: se un singolo passaggio di diluizione non produce buoni risultati, si dovrebbe cercare un altro passo di diluizione. Anche se contro-intuitivo, di soluzioni ad alta concentrazione di analiti raramente producono spettri bene.
Nota: Le proteine di membrana di solito richiedono grandi diluizioni. - 0.5μl posto del campione / matrice miscela sul piatto. Un precipitato biancastro si forma a livello di interfaccia tra lo strato sottile e la goccia. Questo precipitato è la cocrystallization della matrice e dell'analita. Quando questo strato copre la parte inferiore della goccia interamente, USUalleato entro 10-15 secondi, aspirare il liquido in eccesso con una linea a vuoto. Se passano più di 30 secondi per il precipitato di forma, può essere un'indicazione di una agenti contaminanti presenti, che impedisce la cristallizzazione, o il vostro analita è troppo concentrato.
Calibrante applicazione
- Preparare il calibrante / matrice miscela in maniera simile, con una concentrazione finale calibrante tra 0,1 0.5μM.
- 0.5μl Spot calibrante / matrice miscela sul piatto in prossimità dei punti di campionamento. Questa vicinanza fisica viene utilizzato in un pseudo-interno procedura di taratura, in cui si sposta il piatto dal dischetto campione al posto calibrante durante l'acquisizione del campione, per aggiungere un paio di colpi di laser del calibranti allo spettro. Questo approccio garantisce una taratura più alta accuratezza di massa di calibrazione esterno.
Lavaggio passo
- Lavare ogni posto con circa 2μL di un freddo ghiaccio soluzione acquosa 0,1% TFA. Aspirare il liquido in eccesso con una linea a vuoto.
Acquisizione di spettri di massa
- Ora siete pronti ad acquisire spettri di massa. Se si utilizza la soluzione di matrice FWI, è necessario acquisire il tuo spettri il più presto possibile per prevenire modifiche irreversibili all'analita come formylation.
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References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
