Preparación de tejidos para ser visto en diapositivas Un colonoscopio se puede pasar en el colon a través del recto. Un colonoscopio es un tubo largo que tiene la iluminación y una cámara de vídeo a la cabeza, la habilidad de pasar el aire en el colon para hacerlo estallar como un globo largo para permitir una mejor visualización del colon, y tiene un pasaje de la pinza de biopsia que se pueden más allá de la cámara de vídeo para pellizcar un área de 5.3 milímetros de la superficie interior "piel" o capa de la mucosa del colon que nos dé una muestra de la biopsia. La pinza de biopsia también se puede utilizar para eliminar posibles pólipos precancerosos en el colon. Se obtuvieron biopsias de tejidos normales la mucosa del colon de los pacientes, con el consentimiento informado. Estos pacientes fueron sometidos a una colonoscopia de cribado en una clínica gastrointestinal. Nuestra biopsias fueron colocados en frascos de formol. Después de 4 horas, la formalina fue reemplazado por el 70% de alcohol. Muestras similares de tejido se tomaron de las áreas de las resecciones de colon, extirpar durante la cirugía, que fueron de 1 cm y 10 cm de distancia de los cánceres de colon o adenomas con neoplasia avanzada. Estas muestras de tejido también se colocaron en formol, y si las muestras de tejido fueron grandes, algunos se mantuvieron en formol para un período más largo antes de ser colocado en el 70% de alcohol. Las muestras de tejido son llevados a un laboratorio de histología para ser procesados y colocados en bloques de parafina. Los bloques de parafina se enfrían en el refrigerador para que sean más fáciles de cortar por un microtomo. Muestras de tejido de 4 micras de espesor se cortan de los bloques de tejido, usando un micrótomo, y flotaba sobre el agua. Para comparar la expresión de dos proteínas, por ejemplo ERCC1 y PMS2, secciones de tejidos alternativos se pueden recoger en dos diapositivas, hasta que hay tres secciones de tejido en cada una de las dos diapositivas. Por ejemplo, las secciones 1, 3 y 5 se pueden colocar en una diapositiva etiquetados ERCC1 y los artículos 2, 4 y 6 se puede colocar en una diapositiva etiquetados PMS2. Tiene tres secciones de tejido para una proteína inmuno-en una sola diapositiva puede permitir que usted para ver si un patrón de coloración inusual de una cripta es un artefacto o es real, ya que los artefactos no se repetirá en la sección de tejido más de una en una diapositiva. Criptas del colon son alrededor de 60 micras de diámetro, por lo que cerca de 15 secciones de tejido puede ser cortado a través de una cripta, y la misma cripta puede verse en las secciones de tejido múltiple por diapositiva. Inmunotinción secciones de tejido Las diapositivas son puestos por el procedimiento de marcaje inmunohistoquímico. Este es un procedimiento de 8 horas, y es bastante estándar. Las partes del procedimiento que se utiliza, que no son estándar, son el uso de contenedores Sequenza para la tinción y el uso de una solución para reducir la tinción de fondo llamado "Sniper". El "francotirador" La solución se vende como una fórmula patentada por Biocare Médica, Concord CA. Algunos de los pasos de nuestros procedimientos se muestran aquí. A modo de ejemplo, para PMS2 inmunohistoquímica, las diapositivas se deparaffinized primero poniendo en 3 cambios de xileno (3 minutos cada uno), seguidos por dos cambios en el 100% de etanol (2 minutos cada uno), seguidos por dos cambios en el 95% de etanol (2 minutos cada una), seguido de 2 cambios de agua destilada (2 minutos cada uno). Estos procedimientos se llevan a cabo bajo una campana química con presión de aire negativa, para que el experimentador no está expuesto a los vapores. Cuando formalina se utilizó inicialmente para fijar los tejidos, partes de las proteínas en la muestra de tejido se reticulado. Ahora tenemos que romper los enlaces cruzados para que un anticuerpo capaz de reconocer la proteína de interés. Las diapositivas se colocan en una solución tampón que se pone a hervir en un horno de microondas. Esto es seguido por 10 minutos en la posición media, seguido de un enfriamiento de 20 minutos en hielo. Este paso tiene que ser probado y ajustado para microondas diferentes, hasta que se logran buenos resultados. Tenga en cuenta que para inmunoticción CCOI o Ku86 se utilizó un tampón de citrato de sodio hecho con ácido cítrico + 9 ml de citrato de sodio 41mL + 450 ml de H 2 O (una memoria intermedia entre los iones de sodio), que tenía un pH de alrededor de 6,0, por ERCC1 se utilizó un tampón de citrato de hecho con ácido cítrico 2,1 g + 1 litro de H 2 O + ~ 5 ml de hidróxido de sodio para llevar el pH a 6.1 (un buffer con un mínimo de iones de sodio en el original), y para PMS2 se utilizó una solución preparada con una solución de 5 ml desenmascarar el antígeno (por VECTOR) + 533mL H 2 O. Diferentes buffers son necesarios para aumentar la interacción de anticuerpos con epítopos proteína en particular. Las diapositivas son puestos en peróxido de hidrógeno al 3% (diluido en metanol) durante 20 minutos seguido de un enjuague con agua destilada durante 3 minutos, y se lavan en tampón fosfato salino (llamado PBS) durante 5 minutos. Las diapositivas se colocan en planos bastidores tinción estrecho llamado Sequenza (Shandon Sistema inmunotinción Sequenza de Thermo Scientific) y lavadas con PBS. Las diapositivas se immunostained para ERCC1 o PMS2 se exponen a 10 minnutos de exposición a un tratamiento adicional de 3 gotas de una solución propietaria, obtenidos a partir de Biocare, llamado "Sniper", que actúa para reducir la tinción no específica de las proteínas de fondo. Los portas se lavan con un tampón "TBST", que es de 1 ml de Tween + 100 ml de Tris 10x + 900 ml de agua destilada [10 veces en Tris es de 24.2 gramos Trizma + 80 gramos de NaCl + 1.000 ml de agua destilada y desionizada + HCl concentrado (aproximadamente 15 ml) para llevar la solución a pH 7,6]. Portaobjetos se lavan tres veces con tampón y 100 microlitros de Dako con biotina anticuerpo secundario a la dilución 1:100 (en bovinos 2% de albúmina de suero compuesto en TBST buffer) se añaden a las diapositivas y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. En este punto, Vectastain ABC (avidina biotina) (de Vector Laboratories) reactivo se preparará, con 2,5 ml de PBS, una solución de baja A, 1 B solución de gota, y la solución se deja reposar durante 30 minutos. Los portas se lavan 3 veces con tampón TBST. Luego 3 gotas de reactivo Vectastain ABC se suma y las diapositivas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de un enjuague dos veces con TBST. Las diapositivas se sumergen en DAB (diamino-benzamida) (2,9 ml DAB + 400 microlitros de PBS + 250 microlitros de peróxido de hidrógeno) durante unos 5 minutos. Las diapositivas se enjuagan dos veces con agua destilada, desionizada. Contratinción se realiza con una solución diluida de hematoxilina durante 10 segundos. Portas se lavan bien con agua corriente y después destilada. Portaobjetos se deshidratan 2 veces durante 2 minutos en etanol al 95%, dos veces durante 2 minutos en etanol al 100% y 2 veces durante 2 minutos en xileno. Un par de gotas de Cytoseal XYL (Richard Allan-científico) se añaden a las diapositivas y aplicar un cubreobjetos. Evaluación inmunohistoquímica de ERCC1, Ku86 y CCOI se realizan utilizando el mismo protocolo que para PMS2, pero sustituyendo el anticuerpo con anticuerpos PMS2 de ERCC1, Ku86 y CCOI se describe en la siguiente tabla. La evaluación de las secciones de tejido de las criptas deficiencia en la expresión de ERCC1, PMS2, Ku86 y CCOI Vamos a ver por primera vez en secciones de tejido bajo un Motic (DM-BA300) fotomicroscopio para la expresión de PMS2 y ERCC1 en las criptas de la mucosa del colon. PMS2 y ERCC1 son las enzimas de reparación del ADN, por lo que se encuentran en el ADN es, en los núcleos de las células de las criptas. Esto se indica en la Figura 1, donde los dos puntos que representan la tinción de color marrón ERCC1, se produce en el núcleo de las células en una cripta. La cripta normal, se muestra por primera vez en el microscopio estaba manchada de ERCC1, y la mancha marrón muestra la ubicación de ERCC1. Destacamos los tipos de células de las criptas, donde "las células caliciformes" son una forma similar a una copa de vino, con núcleos en una pequeña región en la base de las células en el borde exterior de la cripta, y un abombamiento sección, llena de gránulos de mucina blanco en la parte de la célula en el interior de la cripta. Los otros dos tipos de células tienen un aspecto un tanto igual en nuestras secciones de colores, y son los enterocitos y células enteroendocrinas, y sus núcleos también se encuentran en el borde exterior de la cripta, en la base de las células. En las biopsias tomadas de pacientes que nunca tuvieron una neoplasia de colon, o en las biopsias, lejos de cualquier sitio de cáncer de colon, la casi totalidad de los núcleos de todas las criptas muestran el nivel normal alto de expresión de ERCC1 como se muestra aquí. Para orientar nuestras observaciones, las secciones de tejidos obtenidos a partir de biopsias de pacientes con neoplasia de colon no se observan los niveles de expresión de PMS2, ERCC1, CCOI Ku86 o en la mucosa colónica normal. Podemos observar todas las criptas en una sección de tejido normal, con una lente de objetivo de 40x, ya que poco a poco ir a través de una sección de tejido entero y señalar las criptas, las células intersticiales, los nódulos linfáticos en la diapositiva, y la capa muscular (si está presente en la biopsia). También señalan que sólo hay varias células en la base de la cripta, que son las células madre. Estas células madre generan todos los cerca de 2.000 células de la cripta completa. Una célula madre con una mutación o un epimutation puede tomar el nicho de células madre todo. A continuación, la cripta todo puede haber alterado la tinción de una enzima de interés (conversión cripta) como se muestra en esta nueva diapositiva en la que vemos las criptas toda deficiencia de CCOI junto a las criptas que tienen una alta expresión de CCOI. A continuación se muestra una diapositiva de un paciente con un cáncer de colon o un adenoma con neoplasia avanzada. En esta diapositiva, algunas criptas tienen un nivel normal alto de expresión de ERCC1 y algunos tienen niveles más bajos de expresión. Todas las criptas dentro de la sección de tejido son fotografiados en baja resolución con un lente objetivo de 10x, y las imágenes son de baldosas de modo que toda la sección de tejido se ve en una imagen. Las criptas se numeran. Las criptas con alta expresión de la enzima, típico de las criptas en las biopsias de aquí para allá lejosm cualquier tipo de cáncer, se llaman nivel "4" manchas. Otros niveles son "0" si no hay una expresión detectable, "1" si la expresión apenas detectable es evidente, "2" si no está presente la expresión, pero a un nivel mucho más bajo que el nivel 4, y "3" si la expresión es presente en un nivel inferior a 4, pero bastante fuerte. Nos puntos cada diapositiva en el azul imágenes de baja resolución para 4, verde por 3, de color amarillo para dos, el naranja para 1 y el rojo para 0. Aquí mostramos pasando por una sección de una biopsia usando una lente de objetivo de 40x. Nos puntos de las criptas en la imagen de baja resolución. Figura 1. Una cripta del colon mostrando una elevada expresión de ERCC1 en los núcleos de las células de las criptas. Todos los colores en esta imagen se han mejorado también en el contraste y la saturación, utilizando Paint Shop Pro 5. Resultados representante Las secciones de tejido alternativo en diapositivas separadas nos permite ver las criptas del colon misma, con expresión de dos proteínas diferentes se muestra mediante técnicas de inmunohistoquímica. La imagen de una cripta teñido de PMS2 y el manchado misma cripta de ERCC1 se muestra en los microscopios junto con los monitores de ordenador al lado. Esto nos permite determinar si hay deficiencia conjunta de dos proteínas, o si las deficiencias en cada una de las proteínas, mientras que cada uno es frecuente, se produce de forma independiente. Tenemos tres cortes de tejido en cada diapositiva, de modo que cualquier deficiencia evidente en la expresión de una proteína se puede verificar como deficiente en más de una sección, y no debido a un artefacto. En los tejidos circundantes cáncer de colon, donde hay un defecto en el campo dando lugar a que el cáncer, hay una alta frecuencia de las criptas deficiente de ERCC1 y PMS2. También hemos utilizado técnicas de inmunohistoquímica para encontrar la frecuencia de las criptas deficiente para Ku86 y CCOI. En esta diapositiva, pasamos por una sección de tejido toda immunostained para Ku86, usando una lente de objetivo de 40x, y podemos ver que algunas criptas son deficientes para Ku86 en esta sección de tejido. Del mismo modo, en esta diapositiva, pasamos por una sección de tejido toda immunostained para CCOI, usando una lente de objetivo de 40x, y podemos ver que sólo un número moderado de las criptas son deficientes para CCOI.