缺乏PMS2，ERCC1，Ku86，视野缺损CcOI在结肠癌进展

Summary

减少/缺失PMS2和/或整个隐窝ERCC1的表达是在10厘米的结肠腺癌，可能与高可变性和发展为癌症的视野缺损的基础上两侧的频繁事件。 Ku86或CcOI虚寒经常在这些领域的缺陷要少得多。

Abstract

致癌，是公认的“视野缺损”临床上，由于某些癌症的发展相同的组织类型，经常在附近的位置，其他恶性肿瘤的幸存者倾向高。这种视野缺损已表示在结肠癌。在组织周围的结肠腺癌或先进瘤（一个结肠癌的方式）腺瘤周围的正常组织，应在高频率检测，负责在结肠的视野缺损的分子异常，但在低频在无结肠腺瘤患者结肠黏膜。

采用免疫组织化学，在整个结肠腺癌或先进结肠neoplasias两侧10厘米隐窝被发现经常减少或两个DNA修复蛋白，PMS2和/或ERCC1的表达缺席。 PMS2是具有双重作用的蛋白质，DNA错配修复的积极多余的DNA损伤的细胞凋亡以及在需要。 ERCC1的是活跃于DNA的核苷酸切除修复。减少或缺的ERCC1和PMS2表达会造成细胞既增加了生存的能力（凋亡抵抗）和易变性增加。减少或缺的ERCC1和PMS2表达很可能发展为结肠癌的早期步骤。

DNA修复基因Ku86（活跃在DNA非同源末端连接）和细胞色素C氧化酶亚基我参与细胞凋亡的各据报道，在粘膜地区接近结肠癌中的表达下降。然而，免疫组化的表达水平的评价结果​​表明只有从低到适度的频率，他们在现场周围结肠癌或先进的结肠肿瘤周围的缺陷表达缺乏的隐窝。

我们表明，在这里，我们表达ERCC1的，PMS2，Ku86和CcOI隐窝的评价方法。我们表明，整个隐窝PMS2缺陷的频率和ERCC1的往往是高达70％至95％，20厘米长地区周围的结肠瘤的伟大，而缺乏在Ku86频率隐窝中值的2％和隐窝频率CcOI缺乏有在这些地区16％的中值。整个结肠是150厘米长（约5英尺），并在其粘膜层约10万隐窝。 PMS2和ERCC1周围结肠癌的缺陷，从而可能包括1万隐窝。它是从结肠癌的发生​​有缺陷的crypt。

Protocol

准备组织观看幻灯片

1. 一个结肠镜可以通过进入结肠，直肠。一个结肠镜是一个长管，照明和视频摄像头，能够传递到结肠空气吹起来就像一条长长的气球，以便更好地可视化结肠，并有活检钳，可以通过扩展超出了视频摄像头，掐了一个3-5毫米的面积内表面的“皮肤”或结肠的粘膜层，给我们一个活检标本。活检钳也可以用来移除可能在结肠中发现的癌前息肉。
2. 我们获得的正常结肠黏膜组织活检，从病人的知情同意。这些患者接受胃肠诊所的一个结肠镜筛查。福尔马林罐被安置在我们的活组织切片检查。 4小时后，福尔马林取代70％的酒精。
3. 类似的组织样本取自在手术切除，结肠切除术的领域，即1厘米和10厘米的距离先进瘤结肠癌或腺瘤。这些组织样品也被放置在福尔马林，如果组织样本大，有些福尔马林保存在一个较长时期之前被放置在70％的酒精的。
4. 采取组织样本是一个组织学实验室正在处理和放置在蜡块。
5. 冷藏在冰箱中，使他们更容易被削减一个切片蜡块。
6. 从4微米厚的组织切片切组织块，用一个切片，在水中漂浮。
7. ERCC1和PMS2例如，比较两种蛋白质的表达，可以拿起备用组织切片到两张幻灯片，直到每两个幻灯片上有三个组织切片。例如，第1，3，5，可放置标记ERCC1和第2，4和6可以放在一张幻灯片标记PMS2上一张幻灯片。三个组织切片一张幻灯片蛋白免疫染色可以让你看到，如果地穴一个不寻常的染色模式是神器，或者是真实的，因为文物不会在一个以上的组织切片，在幻灯片上重复。结肠隐窝直径约60微米，约15个组织切片，以便可以减少通过一个地穴，和相同的地穴可以在多个组织切片，每张幻灯片。

免疫组织节

1. 幻灯片，然后通过免疫组织化学标记过程。这是8个小时的过程，是相当标准。的过程，我们使用的部分，即不规范，使用染色Sequenza容器，并使用一个解决方案，以减少被称为“狙击手”的背景染色。 “狙击手”的解决方案是出售作为保科医疗，协和CA的专利配方。
2. 这里显示了一些我们的程序步骤。
3. 作为一个例子，PMS​​2免疫组织化学，幻灯片变化对二甲苯（3分钟），在100％的乙醇变化（2分钟），其次是2的变化在95％的乙醇（2分钟，放置第一deparaffinized每件），其次是2蒸馏水的变化（2分钟）。这些程序下进行化学与负压罩，使实验者是不暴露的蒸气。
4. 当福尔马林最初是用来修复组织，部分组织样本中的蛋白质交联。现在，我们需要打破交叉连接，使一种抗体可以识别蛋白。幻灯片放置在缓冲溶液中，这是在微波炉煮沸。这是由介质上设置的10分钟，随后在冰上20分钟冷却。这一步需要不同的微波炉进行测试和调整，直到达到良好的效果。请注意，免疫CcOI或Ku86我们用了9毫升柠檬酸+ + 450ML H _{2 O（}包括钠离子缓冲液），ERCC1我们使用的柠檬酸缓冲液，pH值约6.0 41mL柠檬酸钠柠檬酸钠缓冲液1公升2.1克柠檬酸+ H _{2 O} +〜5毫升氢氧化钠使pH值至6.1（最小的钠离子的缓冲），和PMS2我们用5ML的抗原的揭露解决方案（矢量）+ 533mL提出了解决方案H _{2 O。}不同的缓冲区，需要增加与特定的蛋白质抗原决定簇的抗体相互作用。
5. 一个在蒸馏水冲洗3分钟，洗净磷酸盐缓冲液（PBS）的5分钟20分钟的幻灯片，然后放入3％的双氧水（甲醇稀释）。
6. 幻灯片，然后放置到平面的狭窄染色架，称为Sequenza（Shandon Sequenza Thermo Scientific的免疫染色系统），并用PBS漂洗。
7. ERCC1或PMS2免疫染色的幻灯片，然后暴露于10分钟犹特人接触到3滴Biocare公司获得一个专有的解决方案，被称为“狙击手”的行为，以减少非特异性染色背景蛋白的补充治疗。
8. 幻灯片冲洗缓冲区“TBST”，这是1毫升吐温100毫升10倍三+ 900毫升蒸馏水[10X三是Trizma + 80克氯化钠+ 1,000毫升蒸馏水和去离子水+浓盐酸（24.2克约15毫升），使pH值7.6]的解决方案。
9. 幻灯片，然后用缓冲液冲洗三次，和100微升DAKO公司二抗生物素在1:100稀释（2％牛血清白蛋白在TBST缓冲）添加到幻灯片和30分钟，在室温下孵育。
10. 此时，Vectastain ABC（亲和素生物素复合体）（矢量实验室）试剂准备，用2.5毫升PBS，1滴溶液，1滴溶液B，以及解决的办法是允许站30分钟。
11. 幻灯片用TBST缓冲液漂洗3次。
12. 然后Vectastain农行试剂3滴添加幻灯片室温孵育30分钟，用TBST漂洗2次。
13. 幻灯片，然后沉浸在DAB（二氨基苯甲酰）（2.9毫升民建联+ 400微升PBS + 250微升双氧水）约5分钟。
14. 幻灯片，然后用蒸馏水，去离子水冲洗2次。
15. Counterstaining稀溶液中10秒的苏木。幻灯片在去离子水的自来水彻底冲洗。
16. 幻灯片，然后脱水2次，2分钟，95％的乙醇2分钟，100％的乙醇和二甲苯2分钟的2倍，2倍。
17. 滴Cytoseal XYL（理查德 - 阿兰科学）夫妇将被添加到幻灯片和应用盖玻片。
18. 免疫组化评价的ERCC1，Ku86和CcOI PMS2使用相同的协议，但与抗体取代ERCC1的，Ku86和CcOI PMS2抗体表所述。

隐窝缺乏ERCC1表达，PMS2，Ku86和CcOI评估组织切片

1. 我们将着眼于组织切片下一个麦克奥迪（DM - BA300）photomicroscope PMS2和结肠黏膜隐窝ERCC1的表达。
2. PMS2和ERCC1都是DNA修复酶，所以他们的DNA是位于隐窝细胞的细胞核中，。这是表示在图1，其中棕色的冒号为ERCC1的染色，在隐窝细胞的细胞核中发生。我们首先在显微镜显示正常隐窝染色为ERCC1的，棕色的污渍显示ERCC1的位置。我们指出的隐窝，“杯状细胞”的形状有点像一个酒杯，在小区域基地外缘隐窝细胞的细胞核，出第一个热气球的细胞类型，充满了白色的粘蛋白颗粒隐窝内细胞的一部分。其他两个类型的细胞看起来有点都在我们的染色切片，和他们的肠细胞和肠内分泌细胞，其原子核也外缘隐窝细胞的基础，。在从未有过的结肠瘤的患者，或在远离任何网站结肠癌的活组织切片活检，几乎所有的所有隐窝细胞核正常显示ERCC1表达的高层次，如下所示。
3. 引导我们的观察，从没有结肠瘤患者的活组织切片获得的组织切片观察为表达水平PMS2，ERCC1，CcOI或在正常结肠黏膜Ku86。我们可以观察到所有的地窖，在一个正常的组织切片，用40X物镜，因为我们慢慢地经过一个完整的组织切片，点出的隐窝，间质细胞，在幻灯片上的任何淋巴小结，肌层（如果存在的话在活检）。
4. 我们还指出，有只是几个在干细胞的地穴基础细胞。这些干细胞产生的所有完整的隐窝细胞约2000。一个干细胞与基因突变或epimutation可以接管整个干细胞小生境。然后整个隐窝可能已经改变，因为我们在这个新的幻灯片显示，我们看到CcOI未来CcOI高表达的隐窝缺乏整个隐窝的利益酶（地穴转换）的染色。
5. 接下来，我们从病人与结肠癌或先进腺瘤腺瘤的幻灯片。在这张幻灯片，有隐窝为ERCC1的正常的高表达水平，一些较低水平的表达。所有的组织切片内的隐窝被拍到与10倍物镜的分辨率低，图像，使整个组织切片平铺在一个图像中看到。隐窝，然后编号。
6. 酶的高表达与隐窝，隐窝远来回活检的典型米癌症，被称为水平“4”染色。其他级别的“0”，如果没有表达检测，“1”如果刚刚检测到表达是显而易见的，“2”，如果有表达目前，但比4级的水平要低得多，而“3”如果表达式是目前低于4的水平，但相当强的。我们点4每个幻灯片上的低分辨率图像的蓝色，绿色，3，2黄，橙1和红色为0。在这里，我们将展示通过使用40X物镜部分从活检。我们点上的低分辨率图像的隐窝。

图1。一个结肠隐窝，隐窝细胞的细胞核中的ERCC1高表达。在此图像的所有颜色也同样增强对比度和饱和度，使用Paint Shop Pro的5。

代表性的成果

1. 在单独的幻灯片的替代组织切片，让我们看看在同一结肠隐窝采用免疫组织化学显示出两个不同的蛋白质表达。 PMS2隐窝和相同的crypt染染ERCC1的形象是相邻显微镜与相邻的电脑显示器上显示。这使我们能够确定是否有联合缺乏两种蛋白质，或是否在每个蛋白质的不足之处，而每个频繁，发生独立。我们有三个组织切片，每张幻灯片，使任何一种蛋白质的表达明显缺乏可作为缺乏多个节，而不是由于对工件验证。在组织周围的结肠癌，那里有一个视野缺损引起的癌症，有高频率的缺乏隐窝ERCC1和PMS2。
2. 我们还采用免疫组化发现Ku86和CcOI隐窝缺陷的频率。在这张幻灯片中，我们经过一个完整的组织切片免疫染色为Ku86，使用40X物镜，和我们可以看到，几个隐窝Ku86在这个组织的第中的不足。
3. 同样，在这张幻灯片中，我们通过一个完整的组织切片免疫染色CcOI，使用40X物镜，我们可以看到，只有中等数量的隐窝CcOI缺乏。

Discussion

1. 每张幻灯片中有3个组织切片，这是非常重要。气泡可以发生时，媒体携带抗体，使一些隐窝或部分隐窝可能不能充分染色只是因为泡沫阻止反应的抗体与组织切片。囊直径约60微米，和4微米厚的组织切片，所以可以通过多达15个相同的地穴组织切片。它通常是可以找到相同的地穴，在多个组织部分放在幻灯片上，使用形态为指导的地穴。
2. 在我们最近的研究中，对于大的组织样本，在一个Sequenza染色可能不给组织良好的抗体覆盖。在这种情况下，人们可能更喜欢使用手工染色的组织，是对每个组织样本的手放在一滴含有抗体媒体。
3. 要清楚地看到棕黄色染色，显示表达蛋白的免疫染色，蓝染色显示在计算机显示器上的核DNA，麦克奥迪photomicroscope软件调整如下：增益0，偏移为0，增强，伽马1.00元，0，255 0， 1锐度，颜色校正7，R，G，B增益1.00，和R，G，B亮度0。分辨率设置为1024 × 768，白平衡启用。
4. 我们的方法可以用于任何蛋白质被认为是重要进展结肠癌，以评估他们缺乏的频率，或可能的过度表达，在周边视野缺损先进瘤结肠癌或腺瘤。
   
   
5. 视野缺损进展为癌症的一部分
   术语“领域癌变”最早是由屠宰等。在1953年¹来形容一个地区或上皮细胞的“场”已很大程度上是未知的进程（当时）为前提，从而易患对癌症的发展。初次使用在口腔癌中。从那时起，“领域癌变”和“视野缺损”被更广泛地使用来形容在这新的癌症更可能出现的任何癌前组织，临床肿瘤学领域癌变的概念已日益^受到重视2 。我们最近检讨了在胃肠癌³的视野缺损的证据。在这次检讨，包括在结肠的视野缺损的证据提供了十几个研究的结果。
   
   在结肠黏膜的视野缺损可能出现一个地穴等干细胞中的突变的细胞或细胞表观遗传学改变的自然选择，一个干细胞生存的^利基继承4。遗传不稳定或赋值函数表型，可能是由于DNA的核苷酸切除修复或DNA错配修复的减少，会加速这一进程（以前经常在PMS2 ^缺陷报告结肠癌5周围地区）。如果在正常人群结肠黏膜干细胞，细胞有选择性的优势获得通过突变或epimutation，往往会牺牲邻国干细胞克隆扩大。在结肠黏膜，≤5个细胞，然后会引起所有（约2,000）隐窝细胞的干细胞小生境被占领。一个干细胞小生境的接管由突变或表观遗传学改变的细胞类型的结果，在^“地穴转换“7。
   
   结肠上皮细胞的突变克隆传播（转换隐窝）最常发生^隐窝裂变8。隐窝裂变的一个例子是如图2所示。在这种方式出现的异常组织的修补程序。在这样一个补丁，第二次这样的突变可能会出现这样一个给定的地穴获得的优势，相比其他隐窝内的补丁，并克隆形成一个次要的修补程序，这隐窝内将扩大原有的补丁。在这个新的补丁，这个过程可以反复几个更多的时间，也许几十年，直到出现一种恶性干细胞克隆扩展成癌症。如果这是一般的过程，出现零星结肠腺癌，然后结肠腺癌一般应与，和前面，异常的领域。因此，转换隐窝的补丁可以预料，在该地区的先进腺瘤腺瘤周围，或周围的结肠癌的检出缺陷。
   
   从这个模型前肿瘤的进展，希望找到采取的非肿瘤性结肠肿瘤性病变周围的地区，有可能进展为癌症的结肠黏膜组织样本中的肿瘤进展相关的基因或遗传学改变。特别是，在DNA修复酶，或凋亡所必需的蛋白质，缺陷将有助于进展，加强基因组的不稳定，以及预期可能被发现有缺陷的领域。
6. 选择在PMS2细胞是D时，适用于肾阳虚eficient ERCC1和DNA损伤剂
   奈良等 。同比增长25文化43 - 3B，中国仓鼠卵巢细胞与DNA修复基因ERCC1的失活突变，并处理与DNA损伤剂的文化，MNNG。幸存的细胞DNA损伤的治疗中，从每一种文化中分离单个细胞，并允许以形成一个克隆。所有的克隆分离出约10倍以上的抗MNNG比亲本菌株杀害。孤立的克隆，有22人被证明是在DNA错配修复（MMR）缺陷。这22个克隆中有5个进行了测试，经测序，三个五个PMS2缺陷。选择这PMS2缺陷可能是因为PMS2缺乏引起的抗细胞凋亡，并因此生存的能力，在细胞内的剩余ERCC1的缺席时的DNA损伤。 （通常情况下，PMS2感官DNA损伤水平，并导致细胞发生凋亡，DNA损伤是过度时。）因此，选择在PMS2缺乏ERCC1基因缺陷的细胞DNA损伤时。无性系中ERCC1和PMS2缺陷约500至1000倍的突变率，当与紫外线比亲本细胞照射。
   
   
7. 胆汁酸引起氧化应激，DNA损伤剂，并在发展为结肠癌的重要
   去氧胆酸，胆酸，增加通过氧化应激反应，生成活性氧（ROS）由多个进程，包括破坏^线粒体 10 。最近有证据活性氧造成¹¹后生变化，至少有15个研究表明，胆汁酸，在伴随着高脂肪的饮食浓度的增加，导致DNA ^损伤 12 。伯恩斯坦等 ¹²审查，是膳食脂肪的消耗和结肠癌的发病率之间呈正相关。在饮食中脂肪的胆汁酸被分泌到肠道，胆汁酸作为洗涤剂，以帮助脂肪的消化。因此，高脂肪的饮食与胆汁酸的分泌增加。粪便胆汁酸浓度升高与结肠癌的发病率很高的人群中，过度暴露于胆汁酸作为结肠^致癌 13的主要危险因素。胆汁酸可能是在结肠的视野缺损的原因。

图2。结肠隐窝裂变成3隐窝。

结论

我们发现，在DNA修复基因ERCC1和PMS2在大视场周围结肠癌的缺陷（PMS2也需要凋亡）缺陷的隐窝高频。 ERCC1和PMS2（由于后生变化或突变）的不足之处，可在中央进展结肠癌的遗传不稳定的早期步骤。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMS2 antibody	BD Biosciences	556415
ERCC1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	MS-671-P1
Ku86 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9034
CcO1 antibody	Invitrogen	459600
Biotinylated secondary	Dako	E0413
22% BSA	Informagen, Inc.	2327
Sniper	Biocare Medical	BS966
Vectastain ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34001
Tween 20	USB Corp., Affymetrix	20605
Cytoseal XYL	VWR international	48212-196
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503