Dokular slaytlar üzerinde görülebilir hazırlanması Kolonoskop rektum aracılığıyla kolon içine aktarılabilir. Kolonoskop başında aydınlatma ve bir video kamera olan uzun bir tüp, yeteneği, kolon daha iyi görselleştirme izin uzun bir balon gibi havaya uçurmak için kolon içine hava geçmesi ve Can biyopsi forseps için bir geçiş bize bir biyopsi örneği vermek için iç yüzeyi "deri" ya da kolon mukoza tabakası 3-5 milimetre alan çimdik video kamera ötesine. Biyopsi forseps, aynı zamanda potansiyel olarak kolonda kanser öncesi polipler kaldırmak için kullanılabilir. Bilgilendirilmiş onam, hastanın normal kolonik mukozal dokuların biyopsileri alındı. Bu hastalar gastrointestinal bir klinikte bir tarama kolonoskopi. Biyopsileri formalin kavanoz yerleştirilir. 4 saat sonra% 70 alkol, formalin tarafından değiştirildi. 1 cm ve 10 cm uzakta ileri neoplazi ile kolon kanserleri veya adenomlar kolon rezeksiyonu alanları, ameliyat sırasında çıkarılan doku Benzer örnekleri alınmıştır. Bu doku örnekleri, aynı zamanda formalin yerleştirildi ve doku örnekleri büyük olsaydı, bazı formalin% 70 alkol konuyor önce uzun bir süre için tutuldu. Doku örnekleri, işlenmiş ve parafin bloklar halinde konuyor histoloji laboratuvara alınır. Parafin bloklar, onları daha kolay bir mikrotom tarafından kesilmiş yapmak için buzdolabında soğutulmuş. 4 mikron kalınlığında doku kesitlerinde bir mikrotom kullanılarak doku blokları kesilmiş ve su üzerinde yüzen. Kadar, her iki slaytlar üç doku bölümleri vardır Örneğin ERCC1 ve Pms2 için, iki proteinin ifade karşılaştırmak için, alternatif doku kesitlerinde, iki Slaytlarınıza kaldırdı olabilir. Örneğin, 1, 3 ve 5 bölümleri etiketli bir slayt ERCC1 ve bölüm 2, 4 ve 6 Pms2 etiketli bir slayt üzerine yerleştirilebilir yerleştirilebilir. Tek bir slaytta bir protein için üç doku kesitlerinde immunohistokimyasal bir crypt alışılmadık bir boyanma paterni, eserler bir slayt üzerinde birden fazla doku bölümünde tekrar olmazdı bu yana bir insan yapımı ya da gerçek olduğunu görmek için izin verebilirsiniz. Kolon kript bir crypt ile yaklaşık 15 doku bölümleri kesilmiş olabilir, ve aynı crypt slayt başına birden fazla doku kesitlerinde görülebilir ki, çapı yaklaşık 60 mikron. Doku bölümleri immün Slaytlar sonra immünohistokimyasal etiketleme prosedürü ile konur. Bu 8 saatlik bir işlemdir ve oldukça standarttır. Kullandığınız prosedürü standart olmayan parçalar, boyama Sequenza kapların kullanılması, ve "Keskin Nişancı" olarak adlandırılan arka plan boyama azaltmak için bir çözüm kullanın. "Sniper" çözüm Biocare Tıp, Concord CA tarafından özel bir formülü olarak satılmaktadır. Bazı prosedürler adımları gösterilmiştir. Bir örnek olarak, Pms2 immünohistokimya, slaytlar, 3, 2% 95 etanol içinde değişiklikler (2 dakika takip% 100 etanol (her biri 2 dakika) 2 değişiklik takip ksilen (her biri 3 dakika) koyarak ilk deparafinize her biri), 2 (her biri 2 dakika) distile su ile izledi. Bu prosedürler, deneyci buharına maruz kalmayacak şekilde negatif hava basıncı ile kimyasal kaputun altında yürütülmektedir. Başlangıçta doku düzeltmek için kullanılan formalin, proteinlerin doku örneği parçaları, çapraz bağlı oldu. Şimdi bir antikor ilgi protein tanıyabilir, böylece çapraz bağlantıları kesmek gerekir. Slaytlar, mikrodalga fırın kaynatın getiren bir tampon çözelti konur. Bu orta ayar 10 dakika, 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutma izledi. Bu adım, iyi sonuçlar elde edilir kadar farklı mikrodalga test edilmiş ve ayarlanmış olması gerekiyor. CcOI veya Ku86 immün 9ml sitrik asit + 41mL sodyum sitrat, yaklaşık 6.0 pH ERCC1 için yaptığımız bir sitrat tamponu + 450ml H 2 O (sodyum iyonları da dahil olmak üzere bir tampon) ile yapılan bir sodyum sitrat tampon kullanılan 2.1g sitrik asit + 1 litre H 2 O + ~ 5ml pH 6.1 (asgari katma sodyum iyonları ile bir tampon) getirmek için sodyum hidroksit ve Pms2 için 5ml Antijen açığa çıkarılması bir çözüm (VEKTÖR) + 533mL ile yapılan bir çözüm H 2 O Farklı tamponlar, özel bir protein epitopu antikor etkileşimi artırmak için ihtiyaç vardır. Slaytlar, 3 dakika, distile su ile temizleyin, durulayın ve 5 dakika fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı takip 20 dakika sonra% 3 hidrojen peroksit (metanol içinde seyreltilmiş) konur. Slaytlar sonra Sequenza (Thermo Scientific Shandon Sequenza immün Sistemi) adı verilen düz dar boyama raflara yerleştirilir ve PBS ile durulanır. ERCC1 veya Pms2 immunohistokimyasal slaytlar sonra 10 dakika maruzarka plan proteinlerin non-spesifik boyanması azaltmak için hareket eder Biocare elde edilen "Sniper" denilen özel bir çözüm, 3 damla ilave bir tedaviye maruz dakikalık bir iş. 1 ml Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml distile su [10x Tris Trizma + 80 gram NaCl + 1.000 ml distile ve deiyonize su + konsantre HCl (24.2 gram olduğu bir tampon "TBST" slaytlar ile durulanır yaklaşık 15 ml), pH 7.6] çözüm getirmek. Slaytlar sonra üç kez tamponu ile durulanır, ve DAKO 100 mikrolitre 1:100 dilüsyon (% 2 tampon TBST kadar yapılan sığır serum albumin) orta antikor biotinlenmiş slaytlara eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Bu noktada, Vectastain ABC (Avidin Biotin Kompleksi) (Vektör Laboratories) reaktif, 2.5 ml PBS, 1 damla çözüm A, 1 damla B çözeltisi kullanılarak hazırlanan ve çözümü 30 dakika bekletildikten. Slaytlar TBST tampon ile 3 kez durulanır. Sonra Vectastain ABC reaktifin 3 damla eklenir ve slaytlar TBST ile 2 kez durulama ardından, 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Slaytlar yaklaşık 5 dakika sonra DAB (Diamino-benzamid) (2.9 ml DAB + 400 mikrolitre PBS + 250 mikrolitre hidrojen peroksit) batırılır. Slaytlar sonra 2 kez distile, deiyonize su ile durulanır. Counterstaining hematoksilen 10 saniye boyunca bir çözelti ile yapılır. Slaytlar, deiyonize su ile takip musluk suyu iyice durulanır. Slaytlar sonra susuz 2 kez% 95 etanol içinde 2 dakika, 2 dakika ve 2 kez 2 dakika ksilen% 100 etanol içinde 2 kez. Cytoseal XYL (Richard Allan Bilimsel) Birkaç damla, sonra slayt eklenir ve bir lamel uygulanır. ERCC1, Ku86 ve CcOI immünohistokimyasal değerlendirme Pms2 için aynı protokolü kullanılarak yapılmaktadır, ancak ERCC1, Ku86 ve CcOI antikorlar ile Pms2 antikor yerine aşağıdaki tabloda açıklandığı. ERCC1, ifade eksikliği kript, Pms2, Ku86 ve CcOI için doku bölümleri değerlendirilmesi Biz kolon mukozasında kript Pms2 ve ERCC1 ifade Motic (DM-BA300) fotomikroskopla altında doku kesitlerinde ilk bakacağız. Pms2 ve ERCC1 hem DNA onarım enzimleri ve DNA nerede bu yüzden kript hücrelerinin çekirdekleri, bulunmaktadır. Bu ERCC1 için boyama temsil eden kahverengi kolon, bir crypt hücrelerin çekirdekleri oluşur Şekil 1, belirtilir. Mikroskop ilk gösterisi normal crypt ERCC1 lekeli ve kahverengi leke ERCC1 yerini gösterir. Biz, "goblet hücrelerinin" crypt dış kenarında hücrelerin dibinde küçük bir bölgede çekirdekleri ile, biraz şarap cam gibi şekillenir kript ve balonlaşma bölümünü hücre türleri işaret crypt iç hücre kısmı beyaz musin granülleri ile dolu. Diğer iki tip hücre hem bizim boyanan kesitler görünmesi ve enterositler ve enteroendokrin hücreleri ve çekirdekleri hücrelerin dibinde, crypt dış kenarında da. Kolonik neoplazi hiç hasta, ya da herhangi bir site kadar kolon kanseri biyopsilerinde alınan biyopsiler, burada gösterildiği gibi, hemen hemen tüm kriptlerde çekirdekleri ERCC1 ifade normal yüksek seviyesini gösterir. Yönlendirmek için hiçbir kolonik neoplazi olan hastalarda biyopsi alınan gözlemler, doku bölümleri normal kolon mukozasında Pms2 ifade düzeyleri, ERCC1, CcOI veya Ku86 görülmektedir. Biz yavaş yavaş bütün bir doku kript, interstisyel hücreler, slayt üzerinde herhangi bir lenf nodülleri ve muskularis dışarı bölüm ve nokta ile gitmek gibi (40x objektif lens ile, normal bir doku bölümünde tüm kript izleyebilirsiniz varsa biyopsi). Ayrıca sadece birkaç hücreleri kök hücreler crypt üssünde olduğuna işaret. Bu kök hücreler tam crypt yaklaşık 2.000 hücreleri üretir. Bir mutasyon ya da bir epimutation ile bir kök hücre, kök hücre tamamını niş devralacak. Sonra bütün crypt CcOI yüksek ifade var kript sonraki CcOI eksik bütün kript gördüğünüz bu yeni bir slayt gösterisi olarak ilgi bir enzim (crypt dönüşüm) boyama değişmiş olabilir. Sonra biz, kolon kanseri olan bir hasta ya da ileri neoplazi ile bir adenom bir slayt gösterisi. Bu slaytta, bazı kript ERCC1 normal yüksek düzeyde ifade var ve bazı düşük düzeyde ifade var. Tüm doku bölümü içinde kript 10x objektif lens ile düşük çözünürlükte çekildi, ve tüm doku bölümünde bir görüntü görülür, böylece görüntüler döşenir. Kript sonra numaralandırılmış. Çok biyopsilerinde fro kript enzim yüksek bir ifade ile tipik kriptm herhangi bir kanser, seviye "4" boyama denir. Saptanabilir herhangi bir ifade varsa, zar zor algılanabilir ifade açıktır diğer seviyeler, "1" "0", "2" ifadesi mevcut olup olmadığını, ancak çok daha düşük bir seviye 4 daha düzeyi ve "3" az ifadesi ise 4 daha düşük bir seviyede mevcut, ama oldukça güçlü. Biz, 2 sarı, 3 yeşil turuncu ve kırmızı 0, 1, 4, düşük çözünürlüklü görüntü mavi her slayt nokta. Burada biyopsi 40x objektif lens kullanarak bir bölüm geçiyor göstermektedir. Biz düşük çözünürlüklü görüntü kript nokta. Şekil 1 kript hücrelerinin çekirdekleri ERCC1 yüksek ifade gösteren bir kolon crypt. Bu görüntüdeki tüm renkleri eşit Paint Shop Pro 5 kullanarak, kontrast ve doygunluk geliştirilmiştir. Temsilcisi Sonuçlar Ayrı slaytlar üzerinde alternatif doku kesitlerinde bize immünohistokimyasal olarak gösterilen iki farklı proteinin ifade ile, aynı kolon kript bakmak için izin verir. ERCC1 Pms2 için crypt boyanmış ve aynı crypt boyanmış görüntü komşu bilgisayar monitörleri ile bitişik mikroskoplar gösterilir. Bu bizim ortak eksikliği her sık iken, bağımsız olarak ortaya çıkar, iki protein ya da proteinler her eksiklikleri olmadığını olup olmadığını belirlemek için izin verir. Biz bir protein ifadesinde herhangi bir belirgin eksikliği bir artefakt nedeniyle birden fazla bölüm eksik değil, kontrol edilebilir, böylece slayt başına üç doku bölümleri vardır. , Kansere yol açan bir kusur var kolon kanserleri, çevre dokulara ERCC1 ve Pms2 eksik kript yüksek bir frekans var. Ayrıca Ku86 ve CcOI eksik kriptler frekansını bulmak için immünhistokimya kullanılır. Bu slaytta, Ku86 için immunohistokimyasal 40x objektif lens kullanarak, bütün bir doku bölüm üzerinden gitmek ve biz birkaç kript bu doku bölümü Ku86 için eksik olduğunu görebilirsiniz. Benzer şekilde, bu slaytta, CcOI için immunohistokimyasal 40x objektif lens kullanarak, bütün bir doku bölüm üzerinden gidin ve sadece ılımlı bir kript CcOI için eksik olduğunu görebilirsiniz.