Summary
Medaka 및 zebrafish는 척추 게놈 기능의 유전자 해부에 대한 보완하고 있습니다. 이 프로토콜은 medaka의 배아에 성공 microinjection, 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하여 embryological 및 유전자 분석을위한 중요한 기술에 대한 핵심 포인트를 강조 표시합니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 한 세포 단계의 배아로 medaka microinjection의 기법을 보여줍니다. Medaka는 유전자와 embryological 모두 분석이 가능하고 게놈 차원의 표현형 기반 돌연변이 화면이 zebrafish 및 마우스에서와 같이 1, 실시되었다하는 척추 모델 생물 중 하나입니다 작은 달걀 - 누워있는 민물고기이다. medaka와 zebrafish 사이의 관련 유전자의 기능 중복의 발산 따라서 단일 종 2 medaka 및 zebrafish는 척추 게놈 기능의 유전자 해부에 대한 보완으로 식별할 아르 소설 phenotypes의 신분을 수 있습니다.
배아 투명하고 외부 개발 medaka 생선을 활용하려면, microinjection은 만들기위한 지나친 표현하고 두드리는 다운 관심의 유전자와 DNAs에 대한 상표 세포, mRNAs 또는 방지 감지 oligonucleotides에 대한 휴대 추적기를 삽입하는 필수적인 기술이다 형질 라인.
Protocol
1. 교미하고 알을 수집
- 여성과 남성 medaka 쉽게 항문과 등 지느러미 지느러미의 크기와 모양에 의해 구별 수 있습니다. 수컷의 항문 지느러미는 암컷의에 비해 크고 평행 사변형 모양입니다. 여성 항문 지느러미는 작고 삼각형 모양. 남성 지느러미 지느러미는 지난 두 광선 사이에 명확하게 보이는 깊은 노치 있습니다.
- Medaka 매일 40 달걀을 쌓아 그들은 탱크에 식물에서 하차 제외됩니다 전에 medaka의 여자는 몇 시간 동안 부착 필라멘트에 의해 자신의 뱃속에서 클러스터된 계란을 수행합니다.
- 여자는 그물에 잡힌 한 손으로 양쪽에서 부드럽게 안쪽 개최하실 수 있습니다. 달걀은 부드럽게 다른 손 검지로 배꼽에서 조롱 수 있습니다. 여성은 다음 탱크에 제공될 수 있습니다. 계란은 뭉툭한 포셉 또는 손가락으로 배아 미디어 가득한 6cm 페트리 접시로 전송해야합니다.
- 그들이 작은 짝짓기 상자에 보관하는 경우 Medaka 쌍이 거의 싸움을하지 않습니다. 그들이 먹이와 계란이 몇 달 동안 매일 같은 쌍의에서 수집한 수 수 있도록 그러므로, 그들은 물의 흐름과 작은 탱크에 보관하실 수 있습니다.
- 그것은 배란이 medaka 여성의 일상 발생 이후 여성의 물고기, 남성없이 보관하지 않아야하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 암컷이 알을를 제공하고 몸이 될 수 없습니다.
2. 청소 배아
- 전송 9cm 페트리 접시의 뚜껑에 배치 사포로 유리 피펫 (p2000 그릿 크기, 방수)으로 달걀을 클러스터를 해제한. 초과 매체를 제거하지만 배아의 건조 방지하는 등 충분한 볼륨이 남아 있는지 확인합니다.
- 부드럽게 최소한의 압력을 적용하여 chorion의 외부 표면 머리카락의 일부를 제거하는 주변 45-60초에 대한 모래 종이의 표면에 손가락 평행을 유지, 집게손가락을 사용하는 사포에 배아를 롤. 이주의가 서로 아래 배아를 분쇄의 위험을 최소화합니다 한번에 5-7 배아 이상 올리지 말아요.
- 배아 매체의 신선한 요리로 청소 배아를 전송합니다.
3. microinjection 동안 배아를 개최 아가로 오스 플레이트 만들기
태아도 1.5 % 아가로 오스의 플렉시 글라스의 금형 (그림 1)로 만든 주사하는 동안 골짜기에서 개최됩니다. 아가로 오스의 농도는 정상적으로 배아를 개최하는 것이 중요합니다.
- 첫째, 아가로 오스의 프레임은 플렉시 글라스의 금형을 개최합니다. 9cm 페트리 접시에 0.5cm 깊이로 물에 1.5 % 아가로 오스를 붓고 그것이 완전히 굳은 때까지 기다리십시오. 금형의 크기보다 큰 단지 아가로 오스의 영역을 잘라 버릴거야.
- 자른 영역을 기입도 거품이 갇혀없고 아가로 오스는 굳은 때까지 기다릴되도록 금형을 배치 1.5 % 아가로 오스 하거라. 이 아가로 오스 플레이트는 solidifaction 속도를 냉장고에 저장할 수 있습니다.
- 계란을 가질 골짜기를 창조하는 곰팡이를 제거합니다. 필요한 ° C까지 4 금형, 표지 및 저장 젖어 정도로 배아 매체를 추가합니다.
그림 1. microinjection을 위해 아가로 오스 플레이트의 골짜기를 준비하는 데 사용되는 사용자 정의 만든 금형의 도식.
4. medaka의 배아의 Microinjection
medaka에서 DNA, RNA, morpholino의 oligonucleotides 및 추적 염료는 64 세포 단계의 배아가 아닌 zebrafish에서와 노른자로 1의 세포질에 chorion 통해 microinjected 수 있습니다. 세포질은 rhodamine - dextran이 기술을 개발하는 것이 좋습니다 같은 염료를 주사하여 연습, 작고 medaka에 덜 볼 수 있기 때문에. 추적으로 페놀 레드의 추가도 주사의 확인을 허용하도록합니다.
medaka의 배아를 둘러싼 chorion 힘든이므로, 짧은, 강하고 넓은 주입 바늘은 (그림 2)이 필요합니다. 필라멘트 함유 유리 모세관에서 강력한 넓은 주사 바늘을 준비합니다.
- 추적으로 페놀 레드 주입 솔루션을 준비하고 Eppendorf microloader와 다시에서 바늘에 그것을로드합니다. 공기 펌프 주입기에 바늘을 연결합니다.
- 계란은 한 세포 단계에서 삽입하는 배입니다 가능한 한 빨리 수집하고 클러스터를 해제한해야합니다. 더 많은 배아는 세포 분열을 중지 얼음 (아니 30 분 이상)에 그들을 저장하여 주입 수 있습니다.
그림 2. medaka 및 zebrafish 바늘의 비교. MF 니들의 끝 (상단) 짧고 medaka의 배아를 둘러싼 어려운 chorion를 펑쳐링에 대한 강력한 따라서 넓은됩니다. - 아가로 오스 접시에 달걀을 전송하고 포셉와 골짜기에서 그들을 맞춥니다. 그냥 주사하기 전에 한 세포 세포질의 세포막이 일 치인 수 있도록 다섯 계란은 회전한다수직 전자 바늘. 한 세포의 세포질은 densest 기름 방울로 계란의 측면에 반대 작은 기름 방울의 찾아볼 수없는 영역에 대한보고 찾을 수 있습니다. 확인된 지역은 측면에서 보면 세포질를 확인하실 수 있습니다.
- 바늘 가까이 계란을 넣으십시오. 부드럽게 chorion에 바늘의 팁을 만지거나 microforceps (그림 3)을 사용하여 바늘의 끝부분을 엽니다. 주입 물질의 소량이 밖으로 흐름을 볼 수 있습니다.
- chorion의 바늘 내부의 팁을 곳으로 chorion 통해 찔린. 도 역류가 힘든 chorion (분사 압력 개최 압력과 500 700hPA 80 - 100hPA의 설정)을 통해 주사시 높은 압력으로 인해 발생하지 않도록하기 위해 상대적으로 높은 것으로 인젝터의 개최 압력을 조정합니다.
- 급격히 그 막 파고하여 세포질에 바늘의 끝부분을 삽입합니다.
난황에 바늘의 팁을 삽입하지 마십시오. zebrafish 달리, 노른자에 주입 물질이 세포질로 전송되지 않습니다. 때 세포질의 경계가 흐려 반면 (그림 4) 노른자에 주입하면 주입 액체는 뚜렷한 경계가있다.
때때로 바늘은 아가로 오스 / 파편에 의해 차단 될 수 있습니다. 집게는 터치 / rebreak 바늘의 끝 부분과 막힌를 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 바늘은 주사하는 동안 어느 시점 나면, 버블링은 배아 매체를 보여줄 것입니다 당신이 주입하는 물질이 손실됩니다. 주사는 아가로 오스 채널을 따라 아래로 위로부터하고 금형에 걸쳐 왼쪽에서 오른쪽으로 체계적으로 진행되어야합니다. - 주입 배아가 배아 매체를 포함하는 깨끗한 접시에 전송하고 적절한 온도에서 개발해야합니다.
그림 3. 전에 주사로 바늘 끝 속보. 1 : 가까운 배아의 chorion에 바늘의 끝을 이동, 2 : chorion를 터치하고 팁을 깨고 부드럽게 뒤로하고 앞으로 바늘을 이동, 3 주입 물질의 작은 크기는 바늘의 끝이 밖으로 흐름이 파손을 확인하면 팁니다.
5. 대표 결과
그림 4. 주입 medaka의 배아 대표 이미지. 패널 A는 한 세포 단계의 배아 medaka의 세포질에 rhodamine - dextran의 정확한 주입의 대표 이미지를 보여줍니다. 패널 B는 한 세포 단계의 배아 medaka의 난황에 rhodamine - dextran의 잘못 주입의 대표 이미지를 보여줍니다. 패널 C와 D는 약 30시간 후 분사에서 A와 B 각각 패널에서 배아를 보여줍니다. EM : 배아, 앞쪽에는 C와 D와보기가 지느러미는 패널에서 위쪽으로있다. 염료가 잘못 난황에 주입되면서 패널 D에있는 배 (胚)의 시신이 붉은되지 않습니다. B와 D의 화살표는 rhodamine - dextran가 뚜렷한 원형 경계를 참고 난황에 잘못 주입 나타냅니다. 에서 점선은 A와 B는 한 세포의 세포질의 개요를 나타냅니다, 볼 측면입니다.
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 한 세포 단계의 배아로 medaka 셀 추적, mRNA, DNA 또는 방지 감지 oligonucleotide 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 실시간으로 인 - 생체내 다양한 발달 과정을 공부하고있었습니다. 그것이 내실수이 과정과 이후의 상세한 분석은 크게 척추 organogenesis 및 기본 세포 생물학 우리의 이해를 향상시킬 가능성이있다. 이러한 지식에 대한 중요한, 그리고 재생 의학의 치료 응용 프로그램을 얻을 수 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 MRC에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 4" fine net | Tools | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
| Embryo medium | Reagent | Home made | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
| Micropipette puller | Equipment | Narishige International | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
| Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
| Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarose injection plate | Tools | Home made | For holding embryos during injection. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
