Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

Summary

Medaka und Zebrafisch sind für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen ergänzen. Dieses Protokoll werden die wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Mikroinjektion in medaka Embryonen eine wichtige Technik für embryologische und genetische Analyse mit medaka und Zebrafisch in einem Labor.

Abstract

In diesem Video zeigen wir die Technik der Mikroinjektion in one-Zell-Stadium medaka Embryonen. Medaka ist eine kleine eierlegende Süßwasserfische, dass sowohl genetische und embryologische Analysen ermöglicht und ist eines der Wirbeltiere Modell-Organismen in die genomweite Phänotyp-driven Mutantenscreens out ¹ durchgeführt wurden, wie im Zebrafisch und Maus. Divergenz der funktionellen Überlappung von Genen zwischen medaka und Zebrafisch ermöglicht die Identifizierung von neuen Phänotypen, die nicht identifizierbar sind in einer einzigen Spezies ^2, also medaka und Zebrafisch sind komplementär für Genetische Analyse von Vertebratengenom Funktionen.

Um die Vorteile von medaka Fische, deren Embryonen sind durchsichtig und entwickeln nach außen, ist die Mikroinjektion eine wesentliche Technik, um Zell-Tracer für die Markierung von Zellen, mRNAs oder anti-sense-Oligonukleotide injizieren zur Überexpression und Klopfen-down Gene von Interesse, und DNAs zur Herstellung von transgenen Linien.

Protocol

1. Paarung und sammeln Eier

1. Weibliche und männliche medaka kann leicht durch die Größe und Form des analen und Rückenflossen unterschieden werden. Die Afterflosse der Männchen sind größer und Parallelogramm-förmige Vergleich zu den Weibchen. Die weibliche Afterflosse ist kleiner und Dreieck geformt. Die männlichen Rückenflosse hat eine deutlich sichtbare tiefe Kerbe zwischen den beiden letzten Strahlen.
2. Medaka legen bis zu 40 Eier täglich und medaka Weibchen tragen Eier in ihrem Bauch durch Anlagerung Filamente für mehrere Stunden Cluster, bevor sie in den Werken in den Tank entfernt werden.
3. Frauen können in einem Netz gefangen und gehalten werden innen sanft von beiden Seiten mit einer Hand. Eier können dann vorsichtig aus dem Bauch mit dem Zeigefinger der anderen Hand aufgezogen werden. Das Weibchen kann dann in den Tank zurückgeführt werden. Eier sollten auf einer 6 cm Petrischale mit Embryo Medien durch stumpfe Pinzette oder einem Finger gefüllt übertragen werden.
4. Medaka Paare nur selten zu kämpfen, wenn sie in einem kleinen Paarung Box aufbewahrt werden. Deshalb können sie in einem kleinen Tank mit Wasser fließen gehalten werden, so dass sie verfüttert werden können, und Eier aus dem gleichen Paar gesammelt werden können jeden Tag für ein paar Monate.
5. Es ist wichtig, dass die weiblichen Fische sollten nicht ohne Männchen gehalten werden, da der Eisprung stattfindet Alltag in medaka Frauen. Andernfalls können Frauen nicht liefern Eier und sich unwohl fühlt.

2. Reinigung Embryonen

1. Transfer ohne Cluster Eier mit einer Glaspipette auf Schleifpapier (p2000 Korn, wasserdicht) in den Deckel eines 9cm Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges Medium, sondern sorgen für eine ausreichende Lautstärke bleibt zu verhindern Trocknung von Embryonen.
2. Sanft rollen Embryonen auf Schleifpapier mit dem Zeigefinger, der Anwendung minimal Druck und halten den Finger parallel zur Oberfläche des Sandes Papier für etwa 45-60 Sekunden, um einige der äußeren Oberfläche Haare des Chorion zu entfernen. Rollen Sie nicht mehr als 5-7 Embryonen auf einmal diese Vorsichtsmaßnahme die Gefahr von Quetschungen Embryonen unter einander zu minimieren.
3. Transfer gereinigt Embryonen in ein frisches Gericht Embryo Medium.

3. Machen Agaroseplatten zum Halten Embryonen während der Mikroinjektion

Die Embryonen werden in Mulden während der Injektion mit einem Plexiglas-Form in 1,5% Agarose (Abbildung 1) hergestellt worden war. Die Konzentration der Agarose ist wichtig, dass Embryonen richtig halten.

1. Stellen Sie zunächst einen Rahmen aus Agarose, die Plexiglas-Form zu halten. Gießen Sie 1,5% Agarose in Wasser zu einer 0,5 cm Tiefe in einem 9cm Petrischale und warten, bis es erstarrt vollständig. Schneiden Sie einen Bereich des Agarose nur größer als die Größe der Form.
2. Gießen Sie 1,5% Agarose, um den Schnitt Bereich zu füllen und legen Sie die Form, so dass keine Luftblasen eingeschlossen sind und warten, bis Agarose erstarrt. Diese Agarose Platte kann in den Kühlschrank zu beschleunigen solidifaction gespeichert werden.
3. Entfernen Sie den Schimmel zu Tröge zu schaffen, um die Eier zu halten. Fügen Sie genug Embryo Medium, um die Form, Deckel und lagern bei 4 ° C eintauchen, bis es gebraucht.
   
   
   Abbildung 1. Schematische Darstellung der maßgeschneiderten Form verwendet werden, um Tröge in Agarose-Platten für die Mikroinjektion vorzubereiten.

4. Mikroinjektion von medaka Embryonen

In Medaka, sind DNA-, RNA-, Morpholino-Oligonukleotide und Tracer Farbstoffe durch das Chorion in das Zytoplasma der 1 bis 64-Zell-Stadium Embryos statt den Dotter als im Zebrafisch mikroinjiziert. Da das Zytoplasma ist kleiner und weniger sichtbar in Medaka, Praxis durch die Injektion von Farbstoffen wie Rhodamin-Dextran wird empfohlen, diese Fähigkeiten zu entwickeln. Die Zugabe von Phenolrot als Indikator wird auch aufgefordert, eine Bestätigung der Injektionen zu ermöglichen.

Wie das Chorion umgeben medaka Embryonen ist hart, ist eine kurze, starke und breite Injektionsnadel erforderlich (Abbildung 2). Bereiten Sie diese starke breite Injektionsnadel aus einem Filament-haltigen Glaskapillare.

1. Bereiten Injektionslösung mit Phenolrot als Tracer und laden Sie sie in die Nadel von der Rückseite mit einer Eppendorf Microloader. Schließen Sie die Nadel in die Luft Pumpe-Düse.
2. Eier müssen gesammelt und so bald wie möglich ohne Cluster werden nach der Befruchtung an der Ein-Zell-Stadium zu injizieren. Mehr Embryonen können, indem Sie sie auf dem Eis (nicht länger als 30 Minuten), um die Zellteilung zu stoppen injiziert werden.
   
   
   Abbildung 2. Vergleich medaka und Zebrafisch Nadeln. Beachten Sie die Spitze des MF Nadel (oben) ist kürzer und breiter daher stärker für die Punktion der harten Chorion umgeben medaka Embryonen.
3. Transfer-Eier in die Agarose Platte und richten Sie sie in die Tröge mit einer Pinzette. Kurz vor der Injektion sollte fünf Eier gedreht werden, so dass die Zellmembran der Ein-Zell-Cytoplasma durch th getroffen werden könnene Nadel senkrecht. Das Zytoplasma der one-Zelle kann durch die Suche nach einem Gebiet ohne kleine Öltröpfchen, die gegenüber der Seite des Eies mit dichteste Öltröpfchen gefunden werden. Die identifizierten Bereich kann bestätigt werden, um das Cytoplasma durch Betrachtung von der Seite.
4. Stecken Sie die Nadel in der Nähe der Eier. Öffnen Sie die Spitze der Nadel durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel auf die Chorion oder mit microforceps (Abbildung 3). Eine kleine Menge der Injektion Substanz sollte gesehen abfließen werden.
5. Punktion durch das Chorion an der Spitze der Nadel im Inneren des Chorion Platz. Passen Sie den Nachdruck der Einspritzdüse relativ hoch zu sein, um sicherzustellen, kein Rücklauf erfolgt aufgrund des hohen Drucks auf Punktion durch die harten Chorion (Einstellungen von 80-100hPA für Nachdruck und 500-700hPa für Einspritzdruck).
6. Legen Sie die Spitze der Nadel in das Zytoplasma durch stark Stossen ihrer Membran.
   
   Vermeiden Sie die Spitze der Nadel in den Dotter. Im Gegensatz zu Zebrafisch wird das Material in den Dotter injiziert nicht in das Zytoplasma übertragen werden. Eingespritzten Flüssigkeiten haben eine deutliche Grenze, wenn sie in den Dotter injiziert, während die Grenze verwischt ist, wenn in das Zytoplasma (Abbildung 4).
   
   Gelegentlich kann die Nadel verstopft durch Agarose / Schutt. Pinzetten können verwendet werden, um touch / rebreak Ende der Nadel, und entfernen Sie die Blockierung sein. Wenn die Nadel bricht zu irgendeinem Zeitpunkt während der Injektion wird sprudeln in den Embryo Medium gesehen werden und die Substanz, die Sie spritzen verloren. Die Injektionen sollten systematisch von oben nach unten entlang Agarose-Kanäle und von links nach rechts über die Form durchgeführt.
7. Injizierten Embryonen sollte auf eine saubere Schüssel mit Embryo-Medium übertragen und weiterentwickelt werden bei entsprechender Temperatur.
   
   
   Abbildung 3. Breaking the Nadelspitze vor der Injektion. 1: Bewegen Sie die Nadelspitze in der Nähe des Chorion des Embryos; 2: Tippen Sie auf das Chorion und bewegen Nadel hin und her sanft bis zur Spitze zu brechen; 3: Wenn eine kleine Menge der Injektion Stoffströme aus dem Ende der Nadel dies bestätigt Bruch der Spitze.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 4. Repräsentative Bilder injiziert medaka Embryonen. Panel A zeigt ein repräsentatives Bild der richtigen Injektion von Rhodamin-Dextran in das Zytoplasma einer one-Zell-Stadium medaka Embryo. Panel B zeigt ein repräsentatives Bild der falschen Injektion von Rhodamin-Dextran in den Dottersack eines Ein-Zell-Stadium medaka Embryo. Panels C und D zeigen die Embryonen aus Platten A und B jeweils bei etwa 30 Stunden nach der Injektion. EM: Embryo wird vorderen nach oben in Platten C und D und zeigen Sie ist dorsal. Beachten Sie den Körper des Embryos in Panel D ist nicht rot, wie der Farbstoff wurde falsch in den Dottersack injiziert. Arrows in B und D zeigen, Rhodamin-Dextran injiziert fälschlicherweise in den Dottersack beachten Sie die unterschiedlichen kreisförmige Begrenzung. Die gestrichelten Linien in A und B Umriss des Zytoplasma einer Zelle anzuzeigen, ist eine Ansicht lateral.

Discussion

In diesem Video zeigen wir eine Methode für die Zell-Tracer, mRNA, DNA oder anti-sense-Oligonukleotid-Injektion in einem Zell-Stadium medaka Embryonen. Diese Technik hat uns erlaubt, verschiedene Entwicklungsprozesse Studie in-vivo in Echtzeit. Dieser Prozess und die anschließende detaillierte Analyse bietet es hat das Potenzial, deutlich verbessern unser Verständnis von Wirbeltieren Organogenese und die zugrunde liegenden Zellbiologie. Solches Wissen kann wichtig sein für die, und die Ausbeute therapeutische Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.