Medaka भ्रूण की एक मॉडल जेनेटिक जीव के रूप में उपयोग के लिए Microinjection

Summary

Medaka और zebrafish हड्डीवाला जीनोम कार्यों की आनुवंशिक विच्छेदन के लिए पूरक हैं. इस प्रोटोकॉल medaka भ्रूण में सफल microinjection, embryological और आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है एक प्रयोगशाला में medaka और zebrafish का उपयोग कर के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं पर प्रकाश डाला गया.

Abstract

इस वीडियो में, हम एक सेल चरण medaka भ्रूण में microinjection की तकनीक को प्रदर्शित करता है. Medaka एक छोटे से अंडे बिछाने मीठे पानी मछली है कि दोनों आनुवंशिक और embryological विश्लेषण की अनुमति देता है और एक हड्डीवाला मॉडल जीवों में जो जीनोम चौड़ा phenotype ^{संचालित} उत्परिवर्ती स्क्रीन 1 बाहर किए गए zebrafish और माउस के रूप में , है है. Medaka और zebrafish के बीच संबंधित जीन की कार्यात्मक ओवरलैप के विचलन उपन्यास phenotypes कि एक ^एकल 2 प्रजातियों, इस प्रकार medaka और zebrafish हड्डीवाला जीनोम कार्यों की आनुवंशिक विच्छेदन के लिए पूरक हैं में unidentifiable रहे हैं की पहचान की अनुमति देता है.

Medaka मछली भ्रूण जिसका पारदर्शी होते हैं और बाह्य विकास का लाभ ले करने के लिए, microinjection एक आवश्यक तकनीक बनाने के लिए कोशिकाओं, mRNAs या विरोधी भावना oligonucleotides लेबलिंग के लिए सेल tracers ब्याज की अधिक व्यक्त और दस्तक नीचे जीन, और DNAs के लिए इंजेक्षन ट्रांसजेनिक लाइनों.

Protocol

1. संभोग और अंडे एकत्रित

1. स्त्री और पुरुष medaka आसानी से और गुदा और पृष्ठीय पंख के आकार और आकार से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. पुरुषों की गुदा पंख महिलाओं की तुलना में बड़ा और parallelogram के आकार हैं. महिला गुदा फिन छोटा है और त्रिकोण के आकार का है. पुरुष पृष्ठीय पंख पिछले दो किरणों के बीच एक स्पष्ट रूप से दिखाई दे गहरे निशान है.
2. Medaka हर दिन 40 अंडे को रखना और medaka महिलाओं को कई घंटे के लिए अनुलग्नक filaments द्वारा अपने पेट पर clustered अंडे ले इससे पहले कि वे बंद टैंक में पौधों पर छीन रहे हैं.
3. महिलाओं जाल में पकड़ा जा सकता है है और अंदर धीरे से एक हाथ से दोनों तरफ से आयोजित की. अंडे फिर धीरे से दूसरे हाथ की तर्जनी के साथ पेट से छेड़ा जा सकता है. महिला तो टैंक को लौट जा सकता है. अंडे एक 6 सेमी पेट्री कुंद संदंश या एक उंगली के द्वारा भ्रूण मीडिया के साथ भरा पकवान करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
4. Medaka जोड़े को शायद ही कभी लड़ने जब वे एक छोटे से संभोग के बॉक्स में रखा जाता है. इसलिए, वे पानी के प्रवाह के साथ एक छोटे टैंक में रखा जाना इतना है कि वे किया जा सकता है खिलाया और अंडे एक ही जोड़ी से एकत्र किया जा हर दिन कर सकते हैं महीनों के एक जोड़े के लिए कर सकते हैं.
5. यह महत्वपूर्ण है कि महिला मछली पुरुषों के बिना नहीं रखा होना चाहिए, के बाद से ovulation medaka महिलाओं में हर रोज होता है. अन्यथा, महिलाओं को अंडे नहीं देने और अस्वस्थ बन सकते हैं.

2. सफाई भ्रूण

1. स्थानांतरण एक गिलास sandpaper विंदुक (p2000 धैर्य आकार, निविड़ अंधकार) एक 9cm पेट्री डिश के ढक्कन में रखा के साथ अंडे unclustered. अतिरिक्त मध्यम निकालें लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त मात्रा के रूप में भ्रूण की सुखाने को रोकने के लिए बनी हुई है.
2. धीरे तर्जनी का उपयोग sandpaper पर भ्रूण रोल, कम से कम दबाव लागू करने और रेत कागज की सतह के आसपास 45-60 सेकंड के लिए उंगली समानांतर chorion की बाहरी सतह के बाल के कुछ दूर रखने के. एक बार में 5-7 भ्रूण इस एहतियात एक दूसरे के नीचे कुचल भ्रूण के जोखिम को कम कर देंगे से अधिक मत रोल.
3. भ्रूण के माध्यम से एक ताजा पकवान को साफ भ्रूण स्थानांतरण.

3. Microinjection के दौरान भ्रूण धारण के लिए agarose प्लेटें बनाना

भ्रूण troughs में 1.5% agarose में एक Plexiglass मोल्ड (चित्रा 1) के साथ बनाया इंजेक्शन के दौरान आयोजित की जाती हैं. agarose की एकाग्रता भ्रूण को ठीक से पकड़ करने के लिए महत्वपूर्ण है.

1. सबसे पहले, agarose का एक फ्रेम plexiglass मोल्ड पकड़ बनाने के. पानी में 1.5% agarose एक 9cm पेट्री डिश में 0.5cm गहराई डालो और इंतजार जब तक यह पूरी तरह से solidifies. बस आचारण के आकार से भी बड़ा agarose के एक क्षेत्र से बाहर कट.
2. कट क्षेत्र को भरने के लिए और मोल्ड ताकि कोई बुलबुले फँस रहे हैं और इंतजार जब तक agarose solidifies जगह 1.5% agarose डालो. यह agarose थाली करने के लिए solidifaction गति के लिए रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है.
3. Troughs बनाने के लिए अंडे पकड़ मोल्ड निकालें. 4 में ढालना, कवर और स्टोर विसर्जित डिग्री सेल्सियस जब तक आवश्यक पर्याप्त भ्रूण मध्यम जोड़ें.
   
   
   चित्रा 1 कस्टम बनाया microinjection के लिए agarose प्लेटों में troughs तैयार किया मोल्ड के योजनाबद्ध.

4. Medaka भ्रूण के Microinjection

Medaka में, डीएनए, शाही सेना, morpholino oligonucleotides और दरियाफ्त रंजक chorion के माध्यम से 64 सेल चरण बजाय zebrafish में जर्दी भ्रूण 1 के cytoplasm में microinjected हैं. चूंकि cytoplasm छोटे और कम में दिखाई medaka, rhodamine-dextran करने के लिए इस कौशल विकसित करने के लिए सिफारिश की है जैसे रंगों का इंजेक्शन लगाने के द्वारा अभ्यास है. एक अनुरेखक के रूप में phenol के लाल के अलावा भी करने के लिए इंजेक्शन की पुष्टि की अनुमति देने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है.

Chorion medaka भ्रूण के आसपास के कठिन है, एक छोटी, मजबूत और व्यापक इंजेक्शन सुई की आवश्यकता होती है (चित्रा 2). इस मजबूत व्यापक इंजेक्शन सुई रेशा युक्त एक गिलास केशिका से तैयार करें.

1. Phenol के लाल के साथ एक अनुरेखक के रूप में इंजेक्शन समाधान और तैयार सुई में यह एक Eppendorf microloader साथ वापस से लोड. वायु पंप सुई लगानेवाला सुई कनेक्ट.
2. अंडे एकत्र होना चाहिए और unclustered एक सेल मंच पर इंजेक्षन निषेचन के बाद के रूप में जल्द से जल्द. और भ्रूण उन्हें बर्फ (30 मिनट से अधिक नहीं) पर भंडारण कोशिका विभाजन को रोकने के इंजेक्शन जा सकता है.
   
   
   चित्रा 2 medaka और zebrafish सुइयों की तुलना. नोट एमएफ सुई की नोक (ऊपर) कम है और इसलिए कठिन medaka भ्रूण आसपास chorion puncturing के लिए मजबूत व्यापक है.
3. Agarose प्लेट में अंडे स्थानांतरण और उन्हें संदंश के साथ troughs में संरेखित करें. इंजेक्शन से पहले, बस पांच अंडे घुमाया जा सकता है ताकि एक सेल के cytoplasm कोशिका झिल्ली वें द्वारा मारा जा सकता है है चाहिएई लंबरूप सुई. एक सेल के cytoplasm एक छोटे तेल बूंदों जो densest तेल बूंदों के साथ अंडे की ओर के विपरीत है से रहित क्षेत्र के लिए तलाश द्वारा पाया जा सकता है. पहचान क्षेत्र की ओर से देखने के लिए cytoplasm होने की पुष्टि की जा.
4. सुई अंडे के लिए करीब रखें. सुई की नोक को धीरे chorion सुई की नोक छू या microforceps (चित्रा 3) का उपयोग करके खोलें. इंजेक्शन पदार्थ की एक छोटी राशि के लिए बाहर प्रवाह करने के लिए देखा जाना चाहिए.
5. Chorion chorion के अंदर सुई की नोक जगह के माध्यम से पंचर. सुई लगानेवाला की पकड़ दबाव अपेक्षाकृत उच्च हो, कोई भाटा कठिन chorion (80 100hPA पकड़ और इंजेक्शन के दबाव के लिए दबाव 500-700hPA के लिए सेटिंग्स) के माध्यम से पंचर पर उच्च दबाव के कारण होता है करने के लिए सुनिश्चित करें समायोजित करें.
6. Cytoplasm में तेजी से अपनी झिल्ली poking द्वारा सुई की नोक डालें.
   
   जर्दी में सुई की नोक डालने से बचें. Zebrafish के विपरीत, जर्दी में इंजेक्शन सामग्री cytoplasm में स्थानांतरित नहीं होगा. तरल पदार्थ अंतःक्षिप्त एक अलग सीमा है जब जर्दी में इंजेक्शन जबकि सीमा cytoplasm में जब धुंधला है (चित्रा 4).
   
   कभी कभी सुई agarose / मलबे द्वारा अवरुद्ध हो सकता है. संदंश स्पर्श / सुई के अंत rebreak और रुकावट को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि सुई इंजेक्शन के दौरान किसी भी बिंदु पर टूटता है, बुदबुदाती भ्रूण माध्यम से देखा जाएगा और आप पदार्थ इंजेक्शन हैं खो जाएगा. इंजेक्शन से बाहर किया जाना चाहिए व्यवस्थित agarose चैनलों के साथ नीचे ऊपर से और मोल्ड भर में सही करने के लिए छोड़ दिया से.
7. इंजेक्ट भ्रूण एक साफ भ्रूण मध्यम युक्त डिश के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए और उचित तापमान पर विकसित की है.
   
   
   चित्रा 3 सुई इंजेक्शन के लिए पहले टिप तोड़कर. 1: भ्रूण के chorion के करीब सुई की नोक हटो, 2: chorion टच और सुई पीछे और आगे धीरे को स्थानांतरित करने के लिए टिप तोड़ने, 3: जब इंजेक्शन पदार्थ की एक छोटी राशि सुई के अंत से बाहर बहती है इस टूटना पुष्टि टिप की.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 4 इंजेक्शन medaka भ्रूण के प्रतिनिधि छवियाँ. कक्ष एक rhodamine-dextran के एक मंच के एक सेल medaka भ्रूण के cytoplasm में सही इंजेक्शन के एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है. पैनल बी rhodamine-dextran के गलत इंजेक्शन के एक मंच के एक सेल medaka भ्रूण की जर्दी थैली में एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है. पैनलों सी और डी पैनल से भ्रूण लगभग 30 घंटे के बाद इंजेक्शन पर ए और बी क्रमशः दिखाने. EM: भ्रूण, पूर्वकाल पैनल में ऊपर की तरफ है सी और डी और देखने पृष्ठीय है. नोट पैनल विकास में भ्रूण के शरीर में लाल के रूप में डाई ग़लत ढंग से की जर्दी थैली में इंजेक्ट किया गया था नहीं है. बी और डी में तीर से संकेत मिलता है rhodamine dextran जर्दी थैली में गलत तरीके से इंजेक्शन अलग परिपत्र सीमा ध्यान दें. बिंदीदार लाइनों में ए और बी एक सेल के cytoplasm की रूपरेखा से संकेत मिलता है, देखने पार्श्व है.

Discussion

इस वीडियो में, हम एक सेल चरण medaka भ्रूण में सेल अनुरेखक, mRNA, डीएनए या विरोधी भावना oligonucleotide इंजेक्शन के लिए एक विधि का प्रदर्शन. इस तकनीक हमें विभिन्न विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए वास्तविक समय में में vivo के लिए अनुमति दी गई है. इस प्रक्रिया को और बाद में विस्तृत विश्लेषण यह परमिट के लिए काफी हड्डीवाला organogenesis और अंतर्निहित कोशिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने की क्षमता है. ऐसे ज्ञान के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, और पुनर्योजी चिकित्सा में चिकित्सीय अनुप्रयोगों उपज सकता है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.