Summary
الميداكا الزرد ومكملة للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات. هذا البروتوكول يسلط الضوء على النقاط الرئيسية للنجاح في microinjection الميداكا الأجنة ، وهي تقنية هامة لتحليل الجنينية والجينية باستخدام الميداكا والزرد في المختبر.
Abstract
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح أسلوب واحد في microinjection الخلية مرحلة الأجنة الميداكا. الميداكا صغيرة أسماك المياه العذبة وضع البيض على حد سواء التي تتيح التحليلات الجينية والجنينية ، وهي واحدة من الكائنات الفقارية في نموذج التي أجريت على مستوى الجينوم النمط الظاهري يحركها شاشات متحولة إلى 1 ، كما هو الحال في الزرد والفأر. اختلاف في تداخل الجينات الوظيفية ذات الصلة بين الميداكا الزرد ويسمح تحديد الظواهر الجديدة التي يتم التحقق من هويته في نوع واحد 2 ، وبالتالي الميداكا الزرد ومكملة للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات.
للاستفادة من الأسماك التي الميداكا الأجنة تتسم بالشفافية وتطوير خارجيا ، microinjection هو تقنية ضرورية لحقن الخلايا استشفاف لخلايا وضع العلامات ، أو [أليغنوكليوتيد] mRNAs المضادة للشعور الإفراط في التعبير عن وهدمت - الجينات في المصالح ، والسلطات الوطنية المعينة لصنع خطوط المعدلة وراثيا.
Protocol
1. التزاوج وجمع البيض
- ويمكن بسهولة الميداكا الإناث والذكور يمكن تمييزها حسب حجم وشكل الزعانف الشرجية والظهرية. الزعانف الشرجية من الذكور هم أكبر وعلى شكل متوازي الاضلاع ، مقارنة مع الإناث. الزعنفة الشرجية الإناث هي أصغر حجما وشكل مثلث. الزعنفة الظهرية الذكور لديه درجة واضحة عميقة بين أشعة الماضيين.
- تكمن الميداكا يصل إلى 40 بيضة كل يوم والإناث الميداكا تحمل البيض متفاوت في البطن بواسطة خيوط المرفق لعدة ساعات قبل أن يتم تجريدهم من الخروج في مصانع في الخزان.
- ويمكن صيدها الإناث في صافي وعقد داخل برفق من الجانبين بواسطة يد واحدة. يمكن أن يكون مثار البيض ثم بلطف من البطن مع السبابة في اليد الأخرى. ثم يمكن للأنثى أن تعاد إلى الخزان. يجب نقل البيض إلى طبق بيتري 6 سم مع وسائل الاعلام مليئة بواسطة ملقط الجنين حادة أو أصبع.
- أزواج الميداكا مكافحة نادرا عندما يتم الاحتفاظ به في مربع صغير التزاوج. ولذلك ، يمكن الاحتفاظ به في خزان واحد صغير مع تدفق المياه بحيث يمكن يمكن جمع الطعام والبيض من الزوج نفسه كل يوم لمدة بضعة أشهر.
- المهم أنه لا ينبغي أن تظل الأسماك الإناث دون الذكور ، لأن التبويض يحدث كل يوم في الإناث الميداكا. خلاف ذلك ، يمكن أن يتم تسليم الإناث البيض ويصبح على ما يرام.
2. تنظيف الأجنة
- نقل unclustered البيض مع ماصة الزجاج لالصنفرة (P2000 حجم حصى ، ماء) توضع في غطاء صحن بيتري 9cm. إزالة الزائدة المتوسطة الحجم ولكن ضمان كاف يبقى لمنع جفاف للأجنة.
- لفة بلطف على الأجنة الصنفرة باستخدام السبابة ، وتطبيق الحد الأدنى من الضغط وحفظ الاصبع موازية لسطح الرمل ورقة لحوالي 45-60 ثانية لإزالة بعض الشعرات السطح الخارجي للالمشيماء. لا لفة أكثر من مرة واحدة 5-7 أجنة هذه الاحتياطات من شأنها أن تقلل من خطر سحق الأجنة تحت بعضها البعض.
- نقل الأجنة لتنظيف طبق الطازجة المتوسطة الجنين.
3. صنع لوحات agarose لعقد أجنة خلال microinjection
وتعقد الأجنة في أحواض خلال الحقن المصنوعة من زجاج شبكي في قالب agarose 1.5 ٪ (الشكل 1). تركيز agarose المهم عقد أجنة بشكل سليم.
- الأولى ، وجعل إطار agarose لعقد العفن شبكي. صب agarose 1.5 ٪ في الماء حتى عمق 0.5cm في طبق بتري 9cm وانتظر حتى يتصلب تماما. قطع مساحة أكبر من agarose فقط من حجم القالب.
- صب 1.5 ٪ agarose لملء المساحة الفاصلة ومكان القالب بحيث لا محاصرون فقاعات وانتظر حتى يتصلب agarose. ويمكن تخزين هذا الطبق agarose في الثلاجة لتسريع solidifaction.
- إزالة العفن لإنشاء أحواض لعقد البيض. إضافة يكفي المتوسطة الجنين الى غمر العفن ، وتغطي وتخزينها في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
الشكل 1. تخطيطي العرف صنع القوالب المستخدمة في إعداد أحواض في لوحات لagarose microinjection.
4. Microinjection الأجنة الميداكا
في الميداكا ، يتم microinjected DNA ، RNA ، [أليغنوكليوتيد] morpholino والأصباغ من خلال التتبع المشيماء في السيتوبلازم من 1 الى 64 خلية الجنين مرحلة بدلا من صفار البيض كما في الزرد. منذ السيتوبلازم هو أصغر وأقل وضوحا في الميداكا والممارسة من خلال ضخ هذه الأصباغ على النحو الموصى به رودامين - ديكستران لتطوير هذه المهارة. ومما يشجع أيضا إضافة أحمر الفينول باعتباره التتبع للسماح للتأكيد من الحقن.
كما المشيماء المحيطة الأجنة الميداكا صعبة ، مطلوب قصيرة وإبر الحقن قوية واسعة النطاق (الشكل 2). تعد هذه القوة إبرة الحقن واسعة من الزجاج التي تحتوي على خيوط شعري.
- يعد حل الحقن مع أحمر الفينول بوصفها التتبع وتحميله في الإبرة من الخلف مع microloader إيبندورف. الاتصال الإبرة لحاقن مضخة الهواء.
- يجب جمع البيض وunclustered في أقرب وقت ممكن بعد الإخصاب للضخ في مرحلة واحدة الخلية. ويمكن حقن أكثر من الأجنة تخزينها على الجليد (وليس أكثر من 30 دقيقة) لوقف انقسام الخلايا.
الشكل 2. مقارنة الميداكا الإبر والزرد. لاحظ رأس الإبرة MF (أعلى) هو أقصر وأوسع وبالتالي أقوى لثقب المشيماء الصعبة المحيطة الميداكا الأجنة. - نقل البيض إلى لوحة agarose ومواءمتها في أحواض بالملقط. قبل الحقن ، وينبغي أن تكون استدارة خمس بيضات حتى يمكن ضرب غشاء الخلية من السيتوبلازم واحدة خلية الإبرة ه عموديا. يمكن العثور على السيتوبلازم للخلية واحدة من خلال النظر لمساحة خالية من قطرات النفط الصغيرة التي هي المقابل للجانب البيض مع قطرات كثافة النفط. ويمكن التأكد من المنطقة التي تم تحديدها لتكون السيتوبلازم عن طريق عرض من الجانب.
- وضع وثيقة الإبرة إلى البيض. فتح رأس الإبرة بلطف عن طريق لمس رأس الإبرة إلى المشيماء أو باستخدام microforceps (الشكل 3). ينبغي أن ينظر إلى كمية صغيرة من مادة الحقن لتتدفق.
- من خلال ثقب المشيماء إلى مكان غيض من الإبرة من داخل المشيماء. ضبط ضغط عقد حاقن أن تكون عالية نسبيا ، لضمان عدم حدوث ارتداد بسبب ارتفاع الضغط عليه من خلال ثقب المشيماء صعبة (إعدادات 100hPA - 80 للضغط و 500 عقد 700hPA مقابل ضغط الحقن).
- إدراج غيض من الإبرة في السيتوبلازم بوكز حاد في الغشاء.
تجنب إدراج غيض من الإبرة في صفار البيض. خلافا الزرد ، لن مواد تحقن في صفار نقلهم الى السيتوبلازم. حقن السوائل يكون لها حدود متميزة عند حقنه في صفار البيض في حين أن عدم وضوح الحدود عندما تكون في السيتوبلازم (الشكل 4).
قد تصبح أحيانا الإبرة سدت agarose / الحطام. ويمكن استخدام ملقط للمس / rebreak نهاية الإبرة وإزالة الانسداد. إذا كانت إبرة فواصل في أي نقطة خلال الحقن ، سيتبين محتدما في الأجلين المتوسط والجنين ستفقد مضمون كنت عن طريق الحقن. وينبغي إجراء الحقن بشكل منهجي من أعلى إلى أسفل على طول القنوات وagarose من اليسار إلى اليمين عبر العفن. - ينبغي أن تنقل الأجنة إلى حقن تحتوي على طبق نظيف المتوسطة الجنين وضعت في درجة حرارة مناسبة.
الشكل 3. كسر غيض قبل إبرة الحقن. 1 : تحريك رأس الإبرة بالقرب من المشيماء الجنين ؛ 2 : المس المشيماء وتحرك الإبرة الأمام ثم إلى الخلف برفق لكسر غيض ؛ 3 : عندما كمية صغيرة من مادة الحقن يتدفق من نهاية الإبرة هذا يؤكد الكسر من الحافة.
5. ممثل النتائج
الشكل 4. صور الممثل الأجنة الميداكا حقن. لوحة ويظهر صورة ممثل الحقن الصحيح رودامين - ديكستران في السيتوبلازم من جنين واحد المرحلة الميداكا الخلية. لوحة باء يظهر صورة ممثل الحقن غير صحيحة رودامين - ديكستران في الكيس المحي من جنين واحد المرحلة الميداكا الخلية. لوحات جيم ودال إظهار الأجنة من ألواح A و B على التوالي في حوالي 30 ساعة بعد الحقن. EM : الجنين ، هو الأمامية صعودا في لوحات جيم ودال ، والرأي هو الظهرية. علما جسم الجنين في مد الفريق ليس أحمر كما تم حقن الصبغة بشكل غير صحيح في كيس المح. الأسهم في B و D - تشير رودامين ديكستران حقن بشكل غير صحيح في كيس المح علما الحدود متميزة دائرية. الخطوط المنقطة في ألف وباء تشير الخطوط العريضة للسيتوبلازم الخلية واحد ، هو عرض جانبي.
Discussion
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتتبع الخلايا ، مرنا ، الحمض النووي أو المضادة الحس قليل النوكليوتيد حقن الخلايا في واحدة مرحلة الأجنة الميداكا. وقد سمحت لنا هذه التقنية لدراسة العمليات التنموية المختلفة في الجسم الحي ، في الوقت الحقيقي. هذه العملية وتحليل مفصل لاحقا أنه يتيح لديه القدرة على تعزيز كثيرا من فهمنا للorganogenesis الفقاريات وبيولوجيا الخلايا الكامنة. هذه المعرفة قد تكون مهمة ل، ويسفر عن تطبيقات علاجية في الطب التجديدي.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة مقدمة من لجنة نهر الميكونج.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 4" fine net | Tools | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
| Embryo medium | Reagent | Home made | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
| Micropipette puller | Equipment | Narishige International | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
| Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
| Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarose injection plate | Tools | Home made | For holding embryos during injection. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
