Summary
Medaka en zebravissen zijn complementair voor genetische dissectie van gewervelde genoom functies. Dit protocol worden de belangrijkste punten voor een succesvolle micro-injectie in medaka embryo's, een belangrijke techniek voor de embryologische en genetische analyse met behulp van medaka en zebravis in een laboratorium.
Abstract
In deze video, tonen we de techniek van micro-injectie in een-cellig stadium medaka embryo's. Medaka is een klein ei-leggen zoetwatervis dat zowel genetische en embryologische analyses maakt en is een van de gewervelde model organismen waarvan het genoom-brede fenotype aangedreven mutant schermen werden uitgevoerd 1, net als in zebravis en de muis. Divergentie van de functionele overlap van gerelateerde genen tussen medaka en zebravis maakt identificatie van nieuwe fenotypen die niet identificeerbaar zijn in een enkele soort twee, dus medaka en zebravissen zijn complementair voor genetische dissectie van gewervelde genoom functies.
Om te profiteren van medaka vis die als embryo doorzichtig en ontwikkelen extern, micro-injectie is een essentiële techniek om cel-tracers injecteren voor het labelen van cellen, mRNA's of anti-sense oligonucleotiden voor de over-expressie en kloppen-down genen van belang, en de DNA's voor het maken van transgene lijnen.
Protocol
1. Paring en het verzamelen van eieren
- Vrouwelijke en mannelijke medaka kan gemakkelijk worden onderscheiden door de grootte en de vorm van de anale en rugvinnen. De anale vinnen van de mannetjes zijn groter en parallellogram-vormige vergeleken met die van de vrouwtjes. De vrouwelijke anaalvin is kleiner en driehoekige. Het mannetje rugvin heeft een duidelijk zichtbaar diepe inkeping tussen de laatste twee stralen.
- Medaka leggen tot 40 eitjes elke dag en medaka wijfjes dragen de eieren geclusterd op hun buik door gehechtheid filamenten voor enkele uren voordat ze worden ontdaan van in fabrieken in de tank.
- Vrouwtjes kunnen worden gevangen in een net en hield binnen zachtjes aan beide kanten met een hand. Eieren kunnen vervolgens voorzichtig worden geplaagd door de buik met de wijsvinger van de andere hand. Het vrouwtje kan vervolgens worden teruggegeven aan de tank. Eieren moeten worden overgedragen aan een 6 cm petrischaal gevuld met embryo media door botte tang of een vinger.
- Medaka paren zelden te vechten als ze worden bewaard in een klein doosje paring. Daarom kunnen ze worden bewaard in een kleine tank met water stromen, zodat ze kunnen worden gevoed en eieren kunnen worden afgehaald bij het hetzelfde paar elke dag een paar maanden.
- Het is belangrijk dat vrouwelijke vissen niet moet worden gehouden zonder mannetjes, omdat eisprong elke dag in medaka vrouwen. Anders kan vrouwtjes niet leveren eieren en zich onwel gaan voelen.
2. Reinigen van embryo's
- Transfer unclustered eieren met een glazen pipet met schuurpapier (P2000 korrel, waterdicht) geplaatst in het deksel van een 9cm petrischaal. Verwijder overtollig medium, maar zorgen voor een voldoende volume blijft om uitdroging te voorkomen van embryo's.
- Zachtjes roll embryo's op schuurpapier met behulp van de wijsvinger, het toepassen van minimale druk en houden de vinger parallel aan het oppervlak van het zand papier voor ongeveer 45-60 seconden tot enkele van de buitenkant van het chorion haren te verwijderen. Niet rollen meer dan 5-7 embryo's in een keer deze voorzorg zal het risico van verpletterende embryo's onder elkaar te minimaliseren.
- Overdracht schoongemaakt embryo's om een nieuwe schotel van embryo medium.
3. Het maken van agarose platen voor het houden van embryo's tijdens de micro-injectie
Embryo's worden gehouden in bakken tijdens de injectie gemaakt met een plexiglas schimmel in 1,5% agarose (figuur 1). De concentratie van agarose is het belangrijk om goed te houden embryo's.
- Maak eerst een frame van agarose aan het plexiglas mal te houden. Giet 1,5% agarose in water met een 0,5 cm diepte in een 9cm petrischaal en wacht tot het volledig stolt. Knip een deel van de agarose alleen maar groter is dan de grootte van de mal.
- Giet 1,5% agarose om de snede gebied te vullen en de mal, zodat geen luchtbellen gevangen zitten en wachten tot agarose stolt plaats. Dit agarose plaat kan worden opgeslagen in de koelkast te versnellen solidifaction.
- Verwijder de mal om troggen te creëren om de eieren te houden. Voeg genoeg embryo medium om de mal, dek af en op te slaan onder te dompelen bij 4 ° C totdat het nodig is.
Figuur 1. Schema van op maat gemaakte mal gebruikt om de goten te bereiden in agarose platen voor de micro-injectie.
4. Micro-injectie van medaka embryo's
In medaka, zijn DNA, RNA, morpholino oligonucleotiden en tracer kleurstoffen gemicroinjecteerd door het chorion in het cytoplasma van de 1 tot 64-cellig stadium embryo in plaats van de dooier als in de zebravis. Omdat het cytoplasma is kleiner en minder zichtbaar in medaka, de praktijk door het injecteren van kleurstoffen zoals rhodamine-dextran wordt aanbevolen om deze vaardigheid te ontwikkelen. Toevoeging van fenol rood als een tracer is ook aangemoedigd om de bevestiging van injecties toe te staan.
Als het chorion omliggende medaka embryo's is taai, is een kort, krachtig en breed injectienaald vereist (figuur 2). Bereid deze sterke breed injectienaald uit een filament-bevattende glazen capillair.
- Bereid oplossing voor injectie met fenol rood als een tracer en plaats hem in de naald van de achterzijde met een Eppendorf microloader. Sluit de naald om de luchtpomp injector.
- De eieren moeten worden verzameld en unclustered zo snel mogelijk na de bevruchting te injecteren in de een-cellig stadium. Meer embryo's kan worden geïnjecteerd door ze op te slaan op ijs (niet meer dan 30 minuten) om de celdeling te stoppen.
Figuur 2. Vergelijking van de zebravis medaka en naalden. Let op de punt van de naald MF (boven) is korter en breder dus ook sterker voor aanprikken van de stoere chorion omliggende medaka embryo's. - Overdracht eieren in het agarose bord en lijn ze in de troggen met een tang. Net voor injectie moet vijf eieren worden afgewisseld, zodat de celmembraan van de een-cel cytoplasma kan worden getroffen door ee naald loodrecht. Het cytoplasma van de een-cel kan worden gevonden door te zoeken naar een gebied zonder kleine oliedruppels die tegengesteld is aan de zijkant van het ei met dichtste oliedruppeltjes. De geïdentificeerde gebied kan worden bevestigd aan het cytoplasma worden door het bekijken van de zijkant.
- Plaats de naald dicht bij de eieren. Open de punt van de naald door zachtjes aanraken van de punt van de naald naar de chorion of het gebruik van microforceps (figuur 3). Een kleine hoeveelheid van de stof injectie moet worden gezien naar buiten stromen.
- Prik door het chorion aan de punt van de naald binnenkant van de chorion plaats. Stel de holding druk van de injector relatief hoog zijn, om ervoor te zorgen er geen reflux optreedt als gevolg van de hoge druk op lekke band door de taaie chorion (instellingen van de 80-100hPA voor het houden van druk-en 500-700 hPa voor injectie druk).
- Steek de punt van de naald in het cytoplasma door scherp porren zijn membraan.
Steek de punt van de naald in de dooier. In tegenstelling tot de zebravis, zal materiaal geïnjecteerd in de dooier niet worden overgedragen in het cytoplasma. Ingespoten vloeistoffen hebben een duidelijke grens bij injectie in de dooier terwijl de grens is vaag als in het cytoplasma (Figuur 4).
Af en toe kan de naald verstopt raken door agarose / puin. Tang kan worden gebruikt om aan te raken / opnieuw afbrekingen aan het einde van de naald en verwijder de blokkade. Als de naald breekt op enig moment tijdens de injectie, zal borrelen te zien in het embryo medium en de stof die u injecteert verloren zullen gaan. Injecties moeten worden systematisch uitgevoerd van boven naar beneden langs de agarose-kanalen en van links naar rechts over de mal. - Geïnjecteerde embryo's moet worden overgebracht naar een schone schotel met embryo medium en ontwikkeld op de juiste temperatuur.
Figuur 3. Overtreden van de naald voor de injectie. 1: Beweeg punt van de naald dicht bij de chorion van embryo; 2: Raak het chorion en beweeg de naald heen en weer voorzichtig om tip te breken; 3: Wanneer een kleine hoeveelheid van de injectie stofstromen uit het uiteinde van de naald dit bevestigt breuk van de tip.
5. Representatieve resultaten
Figuur 4. Vertegenwoordiger beelden van de geïnjecteerde medaka embryo's. Paneel A toont een representatief beeld van de juiste injectie van rhodamine-dextran in het cytoplasma van een een-cellig stadium medaka embryo. Panel B geeft een representatief beeld van de verkeerde injectie van rhodamine-dextran in de dooierzak van een een-cellig stadium medaka embryo. Panelen C en D tonen de embryo's uit panelen A en B respectievelijk ongeveer 30 uur na de injectie. EM: embryo, anterior naar boven in panelen C en D en bekijk dorsale is. Let op het lichaam van het embryo in paneel D is niet rood als de kleurstof was niet correct geïnjecteerd in de dooierzak. Pijlen in B en D geven aan rhodamine-dextran geïnjecteerd ten onrechte in de dooierzak let op de verschillende cirkelvormige grens. Stippellijnen in A-en B-schets van cytoplasma van een-cel te geven, uitzicht is lateraal.
Discussion
In deze video tonen we een methode voor cel tracer, mRNA, DNA of anti-sense oligonucleotide injectie in een-cellig stadium medaka embryo's. Deze techniek heeft ons in staat gesteld de verschillende ontwikkelings-processen te bestuderen in-vivo in real-time. Dit proces en de daaropvolgende gedetailleerde analyse biedt de potentie heeft om aanzienlijk te verbeteren ons begrip van gewervelde organogenese en de onderliggende celbiologie. Deze kennis kan van belang zijn voor, en de opbrengst therapeutische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de MRC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 4" fine net | Tools | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
| Embryo medium | Reagent | Home made | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
| Micropipette puller | Equipment | Narishige International | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
| Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
| Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarose injection plate | Tools | Home made | For holding embryos during injection. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
