Summary
Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı niteliktedir. Bu protokol, Medaka embriyolara başarılı mikroenjeksiyon, bir laboratuvarda Medaka ve zebrafish kullanarak embriyolojik ve genetik analiz için önemli bir tekniktir için kilit noktaları vurgulamaktadır.
Abstract
Bu video, tek hücreli aşamada Medaka embriyolar içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir. Medaka, hem de genetik ve embriyolojik analizler sağlar ve omurgalı model organizmaların genom fenotip odaklı mutant ekranları Zebra balığı ve fare gibi, 1 gerçekleştirilmiştir hangi bir yumurta küçük bir tatlı su balığı . Medaka ve zebrafish arasında ilgili genlerin fonksiyonel örtüşme Farklılıklar, böylece tek bir türün 2, Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı tanımlanamayan roman fenotiplerinin kimlik sağlar .
Embriyolar, şeffaf ve dışarıdan geliştirmek Medaka balık yararlanmak için, mikroenjeksiyon yapmak için aşırı ifade ve vurma aşağı ilgi genler ve DNA'lar etiketleme hücreleri, ya da anti-sense mRNA'ların oligonükleotidler için tracerlerin hücre enjekte etmek için önemli bir tekniktir transgenik hatları.
Protocol
1. Çiftleşme ve yumurta toplama
- Kadın ve erkek Medaka sırt ve anal yüzgeçlerinin büyüklüğü ve şekli ile kolayca ayırt edilebilir. Kadın ile karşılaştırıldığında erkeklerin anal yüzgeçleri daha büyük ve paralelkenar şekilli. Kadın anal yüzgeci küçük ve üçgen şeklinde. Erkek sırt yüzgeci son iki ışınları arasında açıkça görünür derin bir çentik vardır.
- Medaka her gün 40 kadar yumurta yatıyordu ve tank tesislerinde çıkardı önce Medaka kadın, birkaç saat için ek filamentler göbek kümelenmiş yumurtaları taşımak.
- Kadınlar net yakalanmış ve bir yandan her iki taraftan hafifçe içinde tutulur. Yumurta yavaşça diğer elin işaret parmağı ile karnından alay olabilir. Kadın, daha sonra tank iade edilebilir. Yumurta, embriyo medya ile künt forseps veya parmak ile dolu bir 6 cm Petri kabı transfer edilmelidir.
- Küçük bir çiftleşme kutusuna tutulur Medaka çiftleri nadiren mücadele ediyoruz. Bu nedenle, beslenir ve yumurta, birkaç ay boyunca her gün aynı çifti alınabilir böylece, küçük bir su akışı ile tankında muhafaza edilebilir.
- Bu kadın balık yumurtlama Medaka kadınlarda günlük oluşur, erkek olmadan tutulmalıdır gerektiğini önemlidir. Aksi takdirde, kadınlarda yumurta sunmak ve iyi olmak değildir.
2. Temizleme embriyolar
- Transfer 9cm petri kabı kapağı yerleştirilmiş bir cam pipet zımpara (P2000 tane iriliğine, su geçirmez) ile yumurta unclustered. Aşırı orta çıkarın ancak embriyo kurumasını önlemek için yeterli bir hacim kalmasını sağlamak.
- Yavaşça minimum basınç uygulayarak ve koryon dış yüzey tüyleri bazı kaldırmak için yaklaşık 45-60 saniye parmak kum kağıt yüzeyine paralel tutmak, işaret parmağı kullanılarak zımpara embriyolar rulo. Bu önlem embriyolarının birbirlerine altında ezilme riskini en aza indirecek bir defada 5-7 embriyolar daha fazla rulo etmeyin.
- Embriyo orta taze yemek temizlenmelidir embriyo transferine.
3. Mikroenjeksiyon sırasında embriyoların tutmak için agaroz plakaları yapma
Embriyolar% 1.5 agaroz bir pleksiglas kalıp (Şekil 1) ile yapılan enjeksiyon sırasında olukları yapılmaktadır. Agaroz konsantrasyonu, düzgün embriyolar tutmak için önemlidir.
- İlk olarak, pleksiglas kalıp tutmak için agaroz bir çerçeve yapın. % 1.5 agaroz 0.5cm derinliği 9cm Petri kabındaki su dökün ve tamamen katılaşır kadar bekleyin. Agaroz bir alanda kalıp boyutundan daha büyük kesin.
- % 1.5 agaroz kesim alanını doldurmak ve kabarcıklar sıkışıp kalmasına ve agaroz katılaşır kadar bekleyin böylece kalıp yere dökün. Bu agaroz plaka solidifaction hızlandırmak için buzdolabında saklanabilir.
- Yumurta tutmak için olukları oluşturmak için kalıp çıkarın. 4 gerekli ° C ye kadar kalıp, kapak ve mağaza batırmayın yeterli embriyo orta ekleyin.
Şekil 1 olukları mikroenjeksiyon için agaroz plakaları hazırlamak için kullanılan ölçüye göre kalıp şematik.
4. Medaka embriyolar, Mikroenjeksiyon
Medaka, DNA, RNA, morfolino oligonükleotidler ve tracer boyalar 64-hücreli aşamada embriyo yerine zebrafish gibi sarısı 1 sitoplazma içine koryon yoluyla microinjected. Sitoplazma rodamin-dekstran, bu beceriyi geliştirmek için tavsiye edilir boyalar enjekte edilerek uygulama, Medaka içinde daha küçük ve daha az görünür olduğu için. Fenol kırmızısı bir izleme olarak eklenmesi de enjeksiyon onay izin teşvik edilmektedir.
Medaka embriyoları çevreleyen koryon zor olduğu gibi, kısa, güçlü ve geniş bir enjeksiyon iğnesi gereklidir (Şekil 2). Filament içeren cam kapiller bu güçlü geniş enjeksiyon iğnesi hazırlayın.
- Bir izleme olarak fenol kırmızısı ile enjeksiyon solüsyonu hazırlayın ve bir Eppendorf Microloader arka iğne içine yüklemek. Hava pompası enjektör iğnesi bağlayın.
- Yumurta en kısa sürede tek hücreli aşamada enjekte döllenme sonrasında toplanan ve unclustered olmalıdır. Daha fazla embriyolar hücre bölünmesini durdurmak için buz (30 dakikadan fazla) saklayarak enjekte edilebilir.
Şekil 2 Medaka ve zebrafish iğneler karşılaştırılması. MF iğne ucu (üst) kısa ve sert koryon delinmesiyle Medaka embriyoları çevreleyen güçlü dolayısıyla daha geniş. - Agaroz plaka içine yumurta transferi ve forseps ile olukları hizalamak. Sadece enjeksiyondan önce tek hücre bir sitoplazma ve hücre zarının th vurmak olabilir, bu yüzden beş yumurta rotasyona tabi tutulmalıdıre iğne dik. Tek hücre sitoplazma yoğun yağ damlacıkları yumurta yan karşısında küçük yağ damlacıkları yoksun bir alana bakarak bulunabilir. Belirlenen alanda yan görüş sitoplazma teyit edilebilir.
- Iğne yakın yumurta yerleştirin. Koryon iğne ucu hafifçe dokunarak ya da microforceps (Şekil 3) kullanılarak iğne ucu açın. Enjeksiyon maddenin küçük bir miktarı akmaya görülmelidir.
- Ponksiyon yoluyla koryon iğne içinde ucu yere koryon. Hiçbir reflü sert koryon (tutma basıncı ve enjeksiyon basıncı 500 700hPA 80-100hPA ayarları) ile ponksiyon üzerine yüksek basınç nedeniyle oluşur sağlamak için, nispeten yüksek tutma basıncı enjektör ayarlayın.
- Iğne ucu keskin bir membran alay sitoplazma içine yerleştirin.
Sarısı içine iğne ucu ekleme kaçının. Aksine Zebra balığı, yumurta sarısı içerisine enjekte edilen malzeme sitoplazma içine aktarılabilir. Enjekte sıvılar sitoplazma sınır bulanık ise yumurta sarısı (Şekil 4) enjekte edildiğinde belirgin bir sınır var.
Bazen iğne agaroz / enkaz tarafından engellenmiş olabilir. Forseps, iğne sonuna dokunmatik / rebreak ve tıkanma kaldırmak için kullanılabilir. Iğne, enjeksiyon sırasında herhangi bir noktada kırılırsa, embriyo orta köpüren görülebilir ve madde enjekte kaybolur. Enjeksiyonlar agaroz kanal boyunca alt üst ve kalıp boyunca soldan sağa doğru sistematik olarak yapılmalıdır. - Enjekte edilen embriyolar embriyo orta içeren temiz bir tabak aktarılır ve uygun sıcaklıkta olmalıdır.
Şekil 3, enjeksiyon için önce iğne ucu Breaking . 1: embriyonun koryon yakın iğne ucu hareket ettirin; 2: koryon dokunun ve ucu kırmak için hafifçe geriye ve ileriye doğru hareket iğne, 3: enjeksiyon maddenin küçük bir miktar iğne sonu dışarı akar bu kırılma onayladığında ucu.
5. Temsilcisi sonuçları
Şekil 4 enjekte Medaka embriyolar Temsilcisi görüntüler. Panel A rodamin-dekstran tek hücreli aşamadır Medaka embriyo sitoplazma içine doğru enjeksiyon temsil eden bir görüntü gösterir. Panel B, tek hücreli bir sahne Medaka embriyo yumurta sarısı kesesi içine rodamin-dekstran yanlış enjeksiyon temsil eden bir görüntü gösterir. Paneller C ve D-enjeksiyon sonrası yaklaşık 30 saat A ve B sırasıyla paneller embriyoların göstermektedir. EM: embriyo C ve D ve görünümü dorsal anterior panelleri yukarı doğru. Panel D embriyonun vücut kırmızı boya yanlış yolk kesesi içine enjekte edildi değildir. B ve D Oklar rodamin-dekstran farklı dairesel sınır dikkat yanlış yolk kesesi içine enjekte göstermektedir. Noktalı satır A ve B tek hücre sitoplazma anahat göstermektedir lateral.
Discussion
Bu video, biz, tek hücre sahne Medaka embriyolar içine hücre tracer, mRNA, DNA veya anti-sense oligonükleotid enjeksiyon için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu teknik bize gerçek zamanlı in-vivo çeşitli gelişim süreçlerini incelemek için izin verdi. Bu süreç ve daha sonraki detaylı analiz onu tanıyor, önemli omurgalı organogenez ve temel hücre biyolojisi anlayışımızı geliştirmek için bir potansiyele sahiptir. Bu tür bilgi ve rejeneratif tıp terapötik uygulamalar verim olabilir.
Acknowledgments
Bu çalışma, MRC bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 4" fine net | Tools | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
| Embryo medium | Reagent | Home made | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
| Micropipette puller | Equipment | Narishige International | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
| Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
| Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarose injection plate | Tools | Home made | For holding embryos during injection. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
