Summary
Medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados. Este protocolo pone de relieve los puntos clave para el éxito de microinyección en embriones medaka, una técnica importante para el análisis embriológicos y genéticos con medaka y pez cebra en un laboratorio.
Abstract
En este vídeo, se demuestra la técnica de microinyección en un escenario de células de embriones medaka. Medaka es una pequeña puesta de huevos de peces de agua dulce que permite a los análisis genéticos y embriológicos y es uno de los organismos modelo vertebrado en el que todo el genoma impulsado fenotipo mutante pantallas se llevaron a cabo 1, como en el pez cebra y el ratón. Divergencia de superposición de funciones de los genes relacionados entre medaka y pez cebra permite la identificación de los fenotipos de la novela que no son identificables en una sola especie 2, por lo tanto medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados.
Para aprovechar las ventajas de los peces medaka cuyos embriones son transparentes y desarrollar el exterior, la microinyección es una técnica fundamental para inyectar células marcadores de las células de etiquetado, ARNm o de oligonucleótidos antisentido para la sobre-expresión y derribando los genes de interés, y las autoridades nacionales designadas para la toma de líneas transgénicas.
Protocol
1. El apareamiento y la recolección de huevos
- Medaka mujeres y hombres se pueden distinguir fácilmente por el tamaño y la forma de las aletas anal y dorsal. Las aletas anales de los machos son más grandes y con forma de paralelogramo, en comparación con el de las hembras. La aleta anal femenino es más pequeño y con forma de triángulo. La aleta dorsal macho tiene una muesca profunda claramente visible entre los dos últimos rayos.
- Medaka poner hasta 40 huevos todos los días y las hembras llevan los huevos medaka agrupadas en su vientre por filamentos de unión durante varias horas antes de que se despojó a las plantas en el tanque.
- Las hembras pueden quedar atrapados en una red y mantenida en el interior suavemente de ambos lados con una sola mano. Los huevos se pueden suavemente burla de la barriga con el dedo índice de la otra mano. La hembra puede ser devuelto al tanque. Los huevos deben ser transferidos a una placa de Petri de 6 cm llena de medios de embriones con fórceps romos o un dedo.
- Pares medaka rara vez luchan cuando se mantienen en una caja pequeña de apareamiento. Por lo tanto, se pueden mantener en un pequeño tanque con flujo de agua para que puedan ser alimentados y los huevos se pueden recoger desde el mismo par todos los días durante un par de meses.
- Es importante que las hembras no deben ser mantenidos sin los hombres, ya que la ovulación ocurre todos los días en las mujeres medaka. De lo contrario, las mujeres no pueden entregar los huevos y sentirse mal.
2. Embriones de limpieza
- Transferencia agrupado los huevos con una pipeta de vidrio al papel de lija (P2000 tamaño de grano, resistente al agua) colocado en la tapa de una caja de Petri de 9 cm. Retire el exceso de medio, sino garantizar un volumen suficiente como para evitar que restos de secado de los embriones.
- Ruede suavemente los embriones en el papel de lija con el dedo índice, aplicando una presión mínima y manteniendo los dedos en paralelo a la superficie del papel de la arena durante unos 45-60 segundos para eliminar algunos de los pelos de la superficie externa del corion. No ruede más de 5.7 embriones a la vez esta precaución reducirá al mínimo el riesgo de aplastamiento de los embriones por debajo de la otra.
- La transferencia de embriones limpia con un plato fresco de medio embrión.
3. Hacer las placas de agarosa para la celebración de los embriones durante la microinyección
Los embriones se mantienen en depresiones durante la inyección hecha con un molde de plexiglás en el 1,5% de agarosa (Figura 1). La concentración de agarosa es importante mantener los embriones correctamente.
- En primer lugar, hacer un marco de agarosa para mantener el molde de plexiglás. Vierta agarosa al 1,5% en agua a una profundidad de 0,5 cm en una placa de Petri de 9 cm y esperar hasta que se solidifica por completo. Recorta una zona de la agarosa sólo mayor que el tamaño del molde.
- Vierta agarosa al 1,5% para rellenar el área de corte y colocar el molde para que no queden atrapadas burbujas y esperar hasta que se solidifica de agarosa. Esta placa de agarosa se puede almacenar en el refrigerador para acelerar solidifaction.
- Retire el molde para crear canales para sostener los huevos. Añadir medio embrión suficiente para sumergir el molde, cubrir y guardar a 4 ° C hasta que se necesite.
Figura 1. Esquema de la medida del molde utilizado para preparar los canales en placas de agarosa para la microinyección.
4. Microinyección de embriones medaka
En medaka, ADN, ARN, oligonucleótidos morfolino y tintes trazadores microinyección a través del corion en el citoplasma del 1 al 64 de células embrionarias etapa en lugar de la yema como en el pez cebra. Desde el citoplasma es más pequeño y menos visible en medaka, práctica mediante la inyección de colorantes como la rodamina dextrano se recomienda para desarrollar esta habilidad. Además del rojo de fenol como trazador también se anima a permitir la confirmación de las inyecciones.
A medida que el corion rodea embriones medaka es duro, una aguja corta, fuerte inyección de ancho y es necesario (Figura 2). Prepare esta aguja fuerte inyección de ancho de un filamento de vidrio que contienen capilares.
- Preparar la solución de la inyección con rojo fenol como trazador y cargarlo en la aguja de la parte posterior con un microloader Eppendorf. Conecte la aguja del inyector de aire de la bomba.
- Los huevos se recogerán y agrupado tan pronto como sea posible después de la fertilización para inyectar en el estadio de una célula. Más embriones pueden ser inyectados por el almacenamiento en hielo (no más de 30 minutos) para detener la división celular.
Figura 2. Comparación de las agujas medaka y pez cebra. Tenga en cuenta que la punta de la aguja de MF (arriba) es más corto y más ancho por lo tanto, más fuerte para perforar el corion dura alrededor de embriones medaka. - La transferencia de los huevos en la placa de agarosa y alinearlos en las bateas con una pinza. Justo antes de la inyección, cinco huevos se deben rotar por lo que la membrana celular del citoplasma de una célula puede ser golpeado por THe aguja perpendicularmente. El citoplasma de la célula se puede encontrar buscando en un área desprovista de pequeñas gotitas de aceite que es opuesto al del lado del huevo con gotas de aceite más denso. El ámbito en el que se puede confirmar que el citoplasma de vista desde el lado.
- Coloque la aguja cerca de los huevos. Abra la punta de la aguja tocando suavemente la punta de la aguja para el corion o el uso de microforceps (Figura 3). Una pequeña cantidad de sustancia de la inyección se debe considerar que el flujo hacia fuera.
- Punción a través del corion para colocar la punta de la aguja en su interior del corion. Ajustar la presión de la celebración del inyector a ser relativamente alta, para asegurar que no se produce el reflujo, debido a la alta presión sobre la punción a través del corion duro (configuración de 80-100hPA de presión de mantenimiento y 500 700 hPa para la presión de inyección).
- Inserte la punta de la aguja en el citoplasma por bruscamente empujando su membrana.
No inserte la punta de la aguja en la yema. A diferencia de pez cebra, la sustancia inyectada en la yema no será transferida al citoplasma. Líquidos inyectados tienen un límite distinto cuando se inyecta en la yema de huevo, mientras que la frontera es borrosa cuando está en el citoplasma (Figura 4).
De vez en cuando la aguja puede ser bloqueada por agarosa / escombros. Fórceps puede ser usado para tocar / rebreak el extremo de la aguja y eliminar el bloqueo. Si la aguja se rompe en cualquier momento durante la inyección de burbujas, se verá en el medio del embrión y la sustancia que se inyecta se perderá. Las inyecciones deben ser realizadas de manera sistemática, de arriba abajo a lo largo de los canales de agarosa y de izquierda a derecha en el molde. - Embriones inyectados debe ser transferido a un recipiente limpio con medio embrión y el desarrollo a la temperatura adecuada.
Figura 3. Romper la punta de la aguja antes de la inyección. 1: Mueva la punta de la aguja cerca del corion del embrión; 2: Toca el corion y mover la aguja hacia atrás y hacia adelante suavemente para romper la punta; 3: Cuando una pequeña cantidad de sustancia de inyección fluye fuera de la final de la aguja, lo que confirma la rotura de la punta.
5. Los resultados representativos
Figura 4. Imágenes representativas de inyectar embriones medaka. El panel A muestra una imagen representativa de la inyección correcta de rodamina dextrano en el citoplasma de una célula del embrión etapa medaka. El panel B muestra una imagen representativa de la inyección incorrecta de rodamina dextrano en el saco vitelino de un estado embrionario de las células medaka. Los paneles C y D muestran los embriones de los grupos A y B, respectivamente, en aproximadamente 30 horas después de la inyección. EM: embrión, es anterior al alza en los paneles C y D y el punto de vista es dorsal. Tenga en cuenta que el cuerpo del embrión en el panel D no es rojo como el medio de contraste se inyectó correctamente en el saco vitelino. Las flechas en B y D indican rodamina dextrano inyecta incorrectamente en el saco vitelino en cuenta el límite circular distintas. Las líneas de puntos en A y B indican esquema del citoplasma de una célula, vista es lateral.
Discussion
En este vídeo, se demuestra un método para trazador celular, ARNm, ADN o anti-sentido de la inyección de oligonucleótidos en una etapa de células de embriones medaka. Esta técnica nos ha permitido estudiar diversos procesos de desarrollo in-vivo en tiempo real. Este proceso y el análisis detallado posterior que ofrece tiene el potencial de mejorar significativamente nuestra comprensión de la organogénesis de vertebrados y la biología celular subyacente. Tal conocimiento puede ser importante para el, y el rendimiento de las aplicaciones terapéuticas en medicina regenerativa.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de la MRC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 4" fine net | Tools | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
| Embryo medium | Reagent | Home made | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
| Micropipette puller | Equipment | Narishige International | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
| Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
| Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarose injection plate | Tools | Home made | For holding embryos during injection. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
